Клонирование и очистка рекомбинантного белка презентация

КЛОНИРОВАНИЕ И ОЧИСТКА РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА
ДАНО: последовательность нуклеиновой кислоты (ДНК)
Ожидаемый результат: RFP mCherry

ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ МЕТОДЫ
ПЦР
Электрофорез в агарозном геле
Полиакриламидный гель-электрофорез в денатурирующих условиях

ПЕРВЫЙ ШАГ: ПРОВЕДЕНИЕ ПЦР
Итог: V=100 μl

ВТОРОЙ ШАГ: ПРОВЕДЕНИЕ ЭЛЕКТРОФОРЕЗА
1% раствор агарозы
Для утяжеления пробы добавили краску с глицерином

ТРЕТИЙ ШАГ: ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ ФРАГМЕНТА ДНК

ЧЕТВЕРТЫЙ ШАГ: РЕАКЦИЯ РЕСТРИКЦИИ
Итог: V=20 μl

ПЯТЫЙ ШАГ: ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИЙ ПОРЕЗАННОЙ ПЛАЗМИДЫ И ПОРЕЗАННОГО ПЦР ПРОДУКТА
Для плазмиды концентрация равна 107,8 нг/мкл.
Для фрагмента ДНК концентрация равна 115,1 нг/мкл.

ШЕСТОЙ ШАГ: РЕАКЦИЯ ЛИГИРОВАНИЯ
Итог: получили две пробирке, объем каждой из которых равен V=20 μl

СЕДЬМОЙ ШАГ: ПРОВЕДЕНИЕ ЭЛЕКТРОФОРЕЗА
Маркер
Плазмида pet21a
Плазмида pet21a/res
Amplificate/res

ВОСЬМОЙ ШАГ: ТРАНСФОРМАЦИЯ БАКТЕРИЙ
Клетки подвергаем тепловому шоку (420С , 1 мин)
Опускаем в лед (2 мин)
Растим в дневной культуре (LB, 370С , 1час)
Рассеиваем на чашках Петри

ДЕВЯТЫЙ ШАГ: ИЗЪЯТИЕ КЛЕТОК
Сковырнуть носиком полклона
С обратной стороны подписать номер
В пробирку с 20 μl воды опускаем носик с клоном и крутим на вортексе
Собрали 10 клонов с чашки с ампициллином и 3 с контрольной чашки

ДЕСЯТЫЙ ШАГ: ПРОВЕДЕНИЕ ПЦР
Сначала в каждую пробирку разливаем клетки по 0,5 μl, затем добавляем из микса по 9,5 μl. В итоге получаем 15 пробирок по 10 μl.

ОДИННАДЦАТЫЙ ШАГ: ЭЛЕКТРОФОРЕЗ
Получили два удачных клона: 6 и 9

ДВЕНАДЦАТЫЙ ШАГ: ТРАНСФОРМАЦИЯ ШТАММА ROSETTA
Добавить плазмиду (1 μl) к клеткам; помешать носиком
Оставить пробирку на льду 30 мин
Подвергнуть клетки тепловому шоку (420С) в течение 1 минуты
Оставить пробирку на льду на 2 минуты
Добавить в пробирку 400 μl жидкой среды LB (ночной) и инкубировать пробирку при 370С 500rpm 4 час
Втереть 200 μl клеток в чашки Петри с плотной средой LB
В результате получили 0,56 г осадка клеток rosetta

ТРИНАДЦАТЫЙ ШАГ: РАЗРУШЕНИЕ КЛЕТКИ
Buffer

ЧЕТЫРНАДЦАТЫЙ ШАГ: ЛИЗИРОВАНИЕ КЛЕТОК
На 1 г клеток берем: 5 ml Imidazole
50 μl лизоцима
Держим 20 минут на льду (жидкость становится вязкой)
Воздействуем соникатом (вязкость исчезает)
Центрифугируем 20 минут 15000g 40C
Итог: в осадке содержатся нерастворимые белки, клеточные стенки, остатки ДНК, но большая часть белка mCherry находиться в растворе.

ПЯТНАДЦАТЫЙ ШАГ: ВЫДЕЛЕНИЕ БЕЛКА С ПОМОЩЬЮ NI-NTA
В колонку нанести белок, но не перегрузить. Собрать пару капель проскока
Когда колонка свяжется с белком, нанести washing buffer 30mM 4 ml. Собрать 50 μl раствора после того, как сольем 1 ml
Элюция 200 mM Imidazole, собрать несколько фракций
Итог собрали несколько пробирок с белком в буфере 200 mM Imidazole по 150 μl
Проскок
wash
1-ая фракция
2-ая фракция

ШЕСТНАДЦАТЫЙ ШАГ: ЭЛЕКТРОФОРЕЗ В ПОЛИАКРИЛАМИДНОМ ГЕЛЕ
Добавляем 5х краску
V(пробы)=4μl краски +7μl пробы +9μl воды+SDS=20 μl
Ставим в термостат на 950С на 5 минут

РЕЗУЛЬТАТ ЭЛЕКТРОФОРЕЗА

ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЕ БЕЛКИ