Аффинная хроматография. Лекция 1 презентация

ЛИТЕРАТУРА
Туркова Я.. Аффинная хроматография, пер. с англ.. М., 1980 http://booksshare.net/index.php?id1=4&category=biol&author=tukova-ya&book=1980;
П.Дин, У. Джонсон Аффинная хроматография. Методы. МИР:1988
Л.А. Остерман Хроматография белков и нуклеиновых кислот, 1985. 536 С http://booksonchemistry.com/index.php?id1=3&category=hromatografia&author=osterman-la&book=1985&page=215.

Аффинная хроматография (от латинского affinis - родственный) (биоспецифическая хроматография, хроматография по сродству)
- это метод очистки и разделения белков, основанный на их избирательном взаимодействии с лигандом, ковалентно связанным с инертным нерастворимым носителем (матрицей аффинного сорбента)

ЛИГАНДЫ -
соединения, ковалентно связанные с матрицей, биоспецифически (комплементарно) взаимодействующие с выделяемыми соединениями.
Биоспецифическое взаимодействие основано на стерическом соотвествии взаимодействующих веществ и связано с выполнением биологической функции лиганда и выделяемого соединения.

Примеры биоспецифического взаимодействия
1. фермент – ингибитор
2. фермент – субстрат
3. фермент – активатор
4. антиген – антитело
5. комплементарные нуклеиновые кислоты
6. гормон- клеточный рецептор
7. нейромедиатор – рецептор
8. убиквитин – протеасома
9. фибронектин – коллаген

Этапы аффинной хроматографии

Элюирующие растворы
1. Буферные растворы со значением рН 2,4-2,8
2. Буферные растворы со значением рН > 10
3. Буферные растворы с высокой ионной силой;
4. Буферные растворы с повышенной температурой (< 56 градусов Цельсия);
5. Буферные растворы с добавлением органических растворителей;

6. Буферные растворы с добавлением детергентов;
7. Буферные растворы с добавлением хаотропных соединений (роданид калия или натрия);
8. Буферные растворы с добавлением денатурирующих агентов ( мочевина разрушает водородные связи);

Виды аффинной хроматографии
1. Аффинная хроматография с использованием лиганда индивидуальной специфичности.
2. Аффинная хроматография с использованием лиганда групповой специфичности

Лиганды с индивидуальной специфичностью
1. моноклональные и поликлональные антитела к данному антигену;
2. гаптены;
3. субстрат фермента
4. специфический ингибитор фермента
5. специфический активатор фермента
6. комплементарная ДНК или РНК

Лиганды с групповой специфичностью
1. лектины (конканавалин А, специфически связывающий молекулы, содержащие α-D-маннопиранозил, α-D-глюкопиранозил; лектин из зародышей пшеницы, специфически связывающий N-ацетилглюкозамин);
2. сахара;
3. коферменты (НАД+, НАДФ+, коферментом-А);
4. иммобилизованные нуклеозидфосфаты;

5. триазиновые красители;
6. гепарин;
7. ингибиторы протеаз;
8. консервативные области ДНК (например, промоторы);
9. желатин;
10. хелатирующие агенты

Хелатирующий агент (chelating agent) (от греческого chele — клешня) -
- лиганды, обладающие способностью связывать атомы металлов.
Содержат химические группы, содержащие подвижный протон (например -COOH, -ОН, -SO3H);
Примером хелатирующих агентов служит этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), которая прочно и обратимо связывает двухвалентные катионы

Одним из наиболее перспективных направлений развития аффинной хроматографии оказалось использование ее металохелатного варианта.
В рекомбинантные белки вводится поли - гистидиновая аффинная метка, способная связываться с катионами никеля и других металлов.
Полученный методом генной инженерии белок выделяется методом метало - аффинной хроматографии. За 1 цикл достигается 95% очистка.

Фенилбороновая кислота
Фенилбороновая кислота обладает способностью избирательно связывать молекулы, содержащие цис-диольную группировку, в том числе, такие как углеводы и гликопротеиды. Образующиеся ковалентные связи легко расщепляются в слабокислой среде, а также под действием конкурирующих диолов, таких как этиленгликоль, сорбитол и так далее.

Этапы проведения аффинной хроматографии
1. Подготовка и промывка колонки

Аффинная сорбция
Специфическое связывание взаимодействующего с лигандом соединения.
Отмыв несвязанных соединений.

Элюция – разрыв биоспецифических связей
Для элюции применяется буферный раствор с крайними значениями рН, или со специфическими реагентами

Затем элюат нейтрализуется
На завершающем этапе определяется специфическая активность выделенного соединения и его удельная активность в расчете на мг белка.
Например:

1. Примеры биоаффинных взаимодействий
2. Виды аффинной хроматографии;
3. Металлоаффинная хроматография;
4. Свойства идеального носителя (матрицы) для аффинной хроматографии;