Физиология микроорганизмов: дыхание, размножение. Микробиологические исследования: выделение чистой культуры аэробов, анаэробов презентация

-
Типы энергетического метаболизма
Дыхание МКО. Способы создания анаэробных условий
Размножение МКО, фазы роста бактерий, оценка роста
Выделения чистой культуры (этапы, параметры идентификации)

-
Какова цель культивирования микробов?
Каковы этапы выделения чистой культуры и параметры идентификации микробного вида?

- Конструктивный метаболизм
Все компоненты клетки (АК, нуклеотиды, жиры, углеводы) синтезируются в реакциях полимеризации из АК, фосфатов, сахаров, пуриновых, пиримидиновых оснований, органических кислот. Поставщиками этих строительных блоков являются промежуточные продукты основных путей энергетического метаболизма

Энергетический метаболизм
На строительные процессы необходима Е. Энергия в бактериальной клетке накапливается в виде АТФ
У хемоорганотрофных бактерий реакции, связанные с получением Е – это реакции окисления-восстановления, сопряженные с реакциями фосфорилирования. Окисленный в этих реакциях С выделяется в виде СО2.
Для удаления отщепившегося в этих реакциях водорода (в форме восстановленного НАД) различные бактерии используют различные возможности в зависимости от конечного акцептора водорода (или электронов)

В зависимости от способа получения Е у бактерий 3 типа метаболизма

Ферментация (или брожение) – процесс получения Е, при котором отщепленный от субстрата водород переносится на органические соединения. Кислород в процессе брожения участия не принимает
Ферментироваться могут углеводы, АК, пурины, пиримидины, многоатомные спирты
Не способны сбраживаться ароматические углеводороды, стероиды, каратиноиды, жирные кислоты

Исходя из природы конечных продуктов, различают несколько типов ферментации углеводов
Спиртовое брожение – встречается у дрожжей (конечный продукт – этанол и СО2)
Молочнокислое брожение (2 типа):
- гомоферментативный тип (один продукт – молочная кислота): E. faecalis, S. salivarius, Lactobacillus dulgaricus, L. lactis
- гетероферментативный тип (несколько продуктов- молочная, уксусная к-ты, дополнительно конечными продуктами м.б. СО2, этанол): Lactobacillus, Bifidobacterium
Муравьинокислое брожение – масляная к-та, ацетон, уксусная, капроновая и др. органические к-ты: анаэробные бактерии
- пропионовокислое (пропионобактерии)
- маслянокислое (клостридии)
- уксуснокислое

Дыхание - как акт биологического окисления
Дыхание (или биологическое окисление) — процесс получения Е в реакциях окисления-восстановления, сопряженных с реакциями окислительного фосфорилирования, при котором донорами электронов м.б. органические (у органотрофов) и неорганические (у литотрофов) соединения, а акцептором – только неорганические соединения

У бактерий, обладающих окислительным метаболизмом, акцептором водорода является молекулярный кислород, на который переносится Н2, через мультиферментную систему (дыхательная цепь)
К компонентам этой системы относят локализованные в ЦП мембране ферменты

-
Дыхание микроорганизмов
Путем дыхания микроорганизмы добывают энергию.
Дыхание- биологический процесс переноса электронов через дыхательную цепь от доноров к акцепторам с образованием АТФ.
В зависимости от того, что является конечным акцептором электронов, выделяют аэробное и анаэробное дыхание.

-
При аэробном дыхании конечным акцептором электронов является молекулярный кислород (О2), при анаэробном- связанный кислород ( -NO3 , =SO4, =SO3):
О2 Аэробное дыхание -донор водорода H2O
- нитратное окисление NO3 - (факультативные
анаэробы) донор водорода N2
- сульфатное окисление SO4 - (облигатные
анаэробы) донор водорода H2S

По отношению к О2, по использованию его в процессе получения Е

Аэробное дыхание – наиболее распространенный процесс среди комменсалов и патогенов
Молекулы АТФ образуются при окислительном фосфорилилировании с участием цитохромоксидаз ,флавинзависимых оксидаз и флавинзависимых дегидрогеназ, конечный акцептор электронов – молекулярный кислород
Аэробы нуждаются в свободном кислороде. Облигатные (строгие) аэробы - некоторые виды псевдомонад

Используют О2 в процессах получения Е, но растут при его пониженном
парциальном давлении, т.к. имеют ферменты (гидрогеназы), которые активны только при низких значениях О2 и инактивируются при контакте с сильными окислителями

Анаэробное дыхание – терминальными акцепторами электронов выступают соединения, содержащие «связанный кислород» (нитраты, нитриты, сульфаты, карбонаты, др.)
Облигатные анаэробы не используют О для получения Е, молекулярный О токсичен: убивает или резко ограничивает рост МКО
Clostridium tetani

Факультативные анаэробы растут и размножаются в присутствии кислорода или без него. Они образуют АТФ при окислительном и субстратном фосфорилировании, способны переключаться с окисления на ферментацию (энтеробактерии)
B. аntracis

Аэротолерантные факультативно-анаэробные бактерии растут в присутствии кислорода, но энергию получают с помощью брожения – гетероферментативным молочнокислым брожением (молочнокислые бактерии)
Lactobacterium acidophilum

Аэробное дыхание энергетически более эффективно (синтезируется большее количество АТФ)

ферменты обмена:
Оксиредуктазы- катализируют окислительно- восстановительные реакции
Трансферазы- осуществляют реакции переноса групп атомов
Гидролазы - гидролитическое расщепление различных соединений
Лиазы -катализируют реакции отщепления от субстрата химической группы негидролитическим путем с образованием двойной связи или присоединения химической группы к двойным связям.
Изомеразы- определяют пространственное расположение групп элементов
Лигазы или синтетазы- обеспечивают соединение двух молекул, сопряженное с расщеплением пирофосфатной связи в молекуле АТФ или аналогичного трифосфата.

В процессе аэробного дыхания образуются токсические продукты окисления (H2O2, -О2 - свободные кислородные радикалы), от которых защищают ферменты: каталаза, пероксидаза, пероксиддисмутаза. У анаэробов эти ферменты отсутствуют, также как и система регуляции окислительно- восстановительного потенциала (rH2).

Для культивирования строгих анаэробов создаются условия, позволяющие удалить атмосферный О2 (механические, химические, биологические)
Приборы: анаэростаты, анаэробные боксы (удаление воздуха, затем заполнение емкости инертным газом), СО2 инкубаторы, эксикаторы со свечой
система “Газпак” со специальными газорегенерирующими пакетами, действующими по принципу вытеснения атмосферного воздуха газовыми
смесями в
герметически
закрытых емкостях

добавление в питательные среды редуцирующих О2 в-в (тиогликолят натрия, цистеин, аскорбиновая кислота, сульфиды, кусочки паринхиматозных органов, сахароза)
кипячение сред
использование поглотителей О2 (щелочной пирогаллол)

Рост бактерий – это формирование структурно-функциональных компонентов клетки и увеличение самой бактериальной клетки
Размножение – самовоспроизведение, приводящее к увеличению количества бактериальных клеток в популяции

Бактерии размножаются бинарным делением пополам, реже почкованием
Актиномицеты, как и грибы могут размножаться спорами или путем фрагментации нитевидных клеток
Streptomyces spp./ Актиномицеты

Гр+ бактерии делятся путем врастания синтезирующихся перегородок деления внутрь клеток
Гр- - путем перетяжки в результате образования гантелевидных фигур, из которых затем образуются две одинаковые клетки

Бактерии, заселяющие питательную среду, размножаясь, истощают среду, и рост бактерий прекращается. Такая культура наз. Периодической
Непрерывный рост – при непрерывной подаче свежей питательной среды

Лаг-фаза – период между посевом бактерий и началом их размножения. Продолжительность 4-5 час.
Бактерии увеличиваются в размерах, готовятся к делению, повышается количество НК, белка, др. компонентов кл-ки

Фаза логарифмического роста (экспоненциальная фаза) – период интенсивного деления бактерий – 5-6 час. При оптимальных условиях бактерии могут делиться каждые 20-40 мин. (время генерации 20 мин. – E. coli, 6 час. – M. tuberculosis). Во время этой фазы бактерии наиболее ранимы

Фаза стационарного роста – кол-во жизнеспособных клеток остается без изменений, составляя максимальный уровень. Зависит от вида бактерий, особенностей их культивирования

Фаза гибели (лизиса, спада) – отмирание клеток при истощении питательной среды – от нескольких часов до нескольких недель (энтеробактерии отмирают медленно, бациллы - быстро)

Оценка роста бактерий
Подсчет МКО производят:
В камере Горяева (nх 2х107)
Фотометрический метод ( с применением стандарта мутности, измеряя способность бактериальной суспензии поглощать или рассеивать свет)
Автоматические счетчики (регистрируется заряд поверхности каждой микробной кл-ки)

Счетчик колоний - прибор для подсчета количества живых клеток на плотной питательной среде (КОЕ – колониеобразующие единицы)

Культуральные свойства бактерий
условия роста
характер роста
питательные потребности

Условия роста
рН (для большинства – слабо щелочная,
для вибрионов - щелочная, для микобактерий –
слабокислая)
концентрация кислорода (аэробы,
анаэробы)
плотность (жидкая, плотная,
полужидкая)
осмотическое давление среды

Условия роста
t культивирования влияет на скорость размножения:
- мезофиллы (размножаются в диапазоне 20-400С)
- термофилы (40-600С – актиномицеты, некоторые спороносные бациллы, некоторые варианты кишечной палочки, которые указывают на свежесть фекального загрязнения
- психрофилы (0-200С - возбудитель ДСЛ

Условия роста
освещенность: для фототрофов необходим свет, некоторые условно-патогенные бактерии в зависимости от освещенности образуют пигмент

Характер роста:
Е роста или время культивирования: большинство бактерий культивируют для получения видимого роста 18-48 ч., возбудитель коклюша – 5 суток, M. tuberculosis -3-4 недели и ↑
- внешний вид культуры: на жидких средах рост в виде диффузного помутнения, образование придонного осадка (крупно-, мелкозернистый, хлопьевидный, пылевидный), поверхностной пленки (нежная, грубая, морщинистая), Leptospira не дает видимого роста;

Характер роста:
На плотных средах колонии различаются формой, размерами, поверхностью, прозрачностью, консистенцией, окраской.
Культуры могут быть бесцветными, сероватыми, серо-голубыми (вибрионы)
Окраска определяется способностью синтезировать пигменты. Они различаются по цвету, хим. составу, растворимости: белая, желтая, золотистая у стафилококков, сине-зеленая – у псевдомонад. Пигменты предохраняют клетку от действия УФ-лучей, обезвреживают токсические кислородные радикалы, обладают антибиотическими свойствами

Характер роста
МКО могут давать обильный, пышный рост, умеренный, скудный.
Колонии м.б. крупные (4-5 мм в диаметре), средние (2-4), мелкие (1-2) и карликовые (меньше 1 мм)

Характер роста
Различаются по форме расположения на поверхности среды (выпуклые, плоские, куполообразные, вдавленные, круглые, розеткообразные), по форме краев (ровные, волнистые, изрезанные)
S-форма – колонии с гладкой ровной поверхностью, R-форма – с матовой, шероховатой поверхностью
На полужидких средах при посеве уколом подвижные МКО вызывает помутнение среды, неподвижные – растут только по «уколу», оставляя среду прозрачной

В питательные потребности включают источники углерода, азота, и ростовых факторов, способность бактерий расти на определенных питательных средах.
Одни растут на простых, другие – требовательны к питательным средам

Выделение чистой культуры
Чистая культура - скопление микробов одного вида на плотной или в жидкой питательной среде
Чистые культуры получают из изолированных колоний - обособленных скоплений микробов на плотной среде

Цель исследования – идентификация микробного вида
- позволяет установить таксономическое положение МКО (классифицировать МКО: определить его род, вид, тип)

Этапы выделения чистой культуры
накопление инфекционного материала
получение изолированной колонии
получение чистой культуры
идентификация вида

Параметры идентификации
морфология и тинкториальные свойства
культуральные свойства МКО
биохимическая активность
антигенная характеристика
фаготипирование
факторы патогенности

Некультивируемые формы бактерий
Некоторые неспорообразующие бактерии переходят в некультивируемое состояние, чтобы пережить неблагоприятные для размножения условия окружающей среды: температура, концентрация солей, свет содержание О2, питательных веществ.
Бактерии уменьшаются в размерах, приобретают сферическую форму. В таком состоянии бактерии сохраняют свою метаболическую активность, но не способны к непрерывному клеточному делению. Выявить бактерии в такой форме возможно с помощью ПЦР или специальным крашением

Методы выявления НФБ
метод прямого подсчета жизнеспособных клеток
к исследуемому материалу добавляют в небольшом количестве питательные вещества (дрожжевой экстракт) и налидиксовую кислоту (для подавления синтеза ДНК) на несколько часов
Клетки усваивают питательные вещества и увеличиваются в размерах, но не делятся, поэтому такие увеличенные клетки четко видны в микроскоп и их легко подсчитать
методы цитохимические (образование формазана)
микроауторадиографии
Фото С. Васильевой