Культуры эукариотических клеток презентация

Лекции – 8 часов
Практические занятия – 4 часа Зачет

In vitro – культивирование объектов «в стекле»
(пробирке, колбе, биореакторе) на искусственных питательных средах в стерильных условиях
Культуры клеток – это клетки, растущие или сохраняющие жизнеспособность вне организма (в условиях in vitro)

«В (на) живом» —
внутри организма или на живом организме
«В пробирке» —
вне живого организма

Клеточные технологии включают:
культивирование растительных клеток;
культивирование животных клеток
Цель курса «Культуры эукариотических клеток» – знакомство с методами получения культур клеток, их ведения, а также практическим использованием этих объектов

Главное требование –
соблюдение строгой асептики
Все работы по получению культур растительных и животных клеток, их пересадкам производятся в ламинар-боксах

Ламинар-боксы

Второе условие –
использование специальных питательных сред
Культуральная среда должна обеспечивать все внешние условия, которые клетки имели
in vivo

Способы культивирования растительных клеток
Поверхностное культивирование на плотной (агаризованной) питательной среде
Глубинное культивирование в жидкой питательной среде
Каллусные культуры
Суспензионные культуры

Каллус (от лат. callus — толстая кожа, мозоль)

Каллус - недифференцированные растительные клетки, выращиваемые поверхностным способом на полутвердой питательной среде

Каллус может образоваться не только в искусственных условиях, но и в природе, например, на раневой поверхности. Каллусная ткань способствует зарастанию ран, срастанию прививок и служит для восстановления (регенерации) утраченных органов

1. Выбор экспланта
Эксплант - фрагмент ткани или органа, используемый для получения первичного каллуса

Каллусы однодольных растений обычно получают из зародышей, корней,
отрезков основания стебля
Каллусы двудольных растений могут быть получены практически из любых органов
(отрезков стеблей и корней, мезофилла листа, органов цветка)

Лучшими эксплантами для получения каллуса являются:
молодая ткань;
ткань ответственная за пролиферацию (меристема)
Нежелательно использовать:
одревесневшие ткани;
старые ткани с низким уровнем метаболизма;
плохо пролиферирующие ткани (напр., мякоть плодов);
ткани, покрытые восками, суберином и т.п.

Проращивание простерилизованных семян в асептических условиях дает наиболее пригодный материал для получения каллусов

2. Стерилизация растительного материала
На поверхности органов растений всегда находится эпифитная микрофлора. Эксплант должен быть освобожден от всех видов микроорганизмов (бактерий, грибов, микоплазм и т.д.).
Поверхностная стерилизация освобождает эксплант от наружной инфекции.

АНТИСЕПТИКИ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ ДЛЯ СТЕРИЛИЗАЦИИ РАСТИТЕЛЬНЫХ ТКАНЕЙ:
соединения, содержащие активный хлор, – 0,5-1% (гипохлорит кальция, гипохлорит натрия, хлорная известь, хлорамин);
двухлористая ртуть (сулема), 0,1-1 %-ный раствор;
формалин, 5%-ный раствор;
перекись водорода, 10-20%-ный раствор;
этиловый спирт, 70%-ный раствор;
фенол, 5%-ный раствор;
антибиотики (в случае внутренней инфекции)

ТЕХНИКА ПРОВЕДЕНИЯ СТЕРИЛИЗАЦИИ РАСТИТЕЛЬНОГО МАТЕРИАЛА:
Предварительная стерилизация
(проводят очистку поверхности путем ее промывания проточной водой; обработки этанолом (70%-ный раствор в течение 1 мин), растворами CuSO4 либо KMnO4)
2) Стерилизация
(в условиях ламинар-бокса предварительно простерилизованные ткани помещают в стерилизующий раствор)
3) Постстерилизация
(растительный материал отмывают от стерилизующего агента 3-4 порциями стерильной дистиллированной воды)

3. Перенос стерильных эксплантов на питательную среду

4. Получение первичного каллуса
Образование каллуса, в первую очередь, отмечается на раневой поверхности экспланта

При оптимально подобранной среде первичные каллусы в количестве достаточном для пересадки образуются в течение 3-8 недель в зависимости от вида растения

5. Субкультивирование (пассирование)
Первичный каллус разделяют на части, которые в дальнейшем культивируются отдельно.
Следует обратить внимание на размеры трансплантов, переносимых на свежую питательную среду: если они слишком малы, то дальнейший рост каллуса может быть угнетен.

Каллусные культуры различаются по:
интенсивности роста;
окраске;
консистенции и др.
Типы каллусных культур:

Типы каллусных культур:
рыхлые
(легко распадаются на отдельные клетки);
среднеплотные
(клетки могут быть отделены друг от друга сильным встряхиванием);
плотные
(клетки очень мелкие, не отделяются взбалтыванием)

Направления использования каллусных культур:
изучение процессов цитодифференцировки и морфогенеза;
биохимические и молекулярно-биологические исследования;
изучение механизмов опухолеобразования;
получение суспензионных культур;
регенерация растений, получение новых форм растений;
сохранение в растущем состоянии коллекций разных видов растений

Суспензионная культура – отдельные клетки или клеточные агрегаты, выращиваемые в жидкой питательной среде во взвешенном состоянии

Необходимое условие для поддержания суспензионных культур –
постоянное перемешивание питательной среды

удобная модель для молекулярно-биологических и биохимических исследований;
(клетки в одинаковой степени доступны для внешнего воздействия, более «открыты»);
возможность быстрого набора биомассы для получения БАВ;
простота процессов субкультивирования
(легко заменить или отобрать питательную среду)
ОСНОВНЫЕ ПРЕИМУЩЕСТВА СУСПЕНЗИОННЫХ КУЛЬТУР:

1. Отбор хорошо растущей каллусной культуры рыхлого типа
2. Инициализация первичной суспензии
2-3 г свежей массы каллусной ткани на 60-100 мл жидкой питательной среды.
3. Культивирование
Колбы помещают на качалку, скорость вращения которой составляет 100-120 об/мин.
Процесс получения первичной суспензии занимает 2-3 недели.
ЭТАПЫ ПОЛУЧЕНИЯ:

Суспензионные культуры состоят из:
отдельных клеток;
клеточных групп (2-10 клеток);
многоклеточных агрегатов (сотни и тысячи клеток).

А
В
С
С

слабоагрегированные;
(состоят из одиночных клеток (40%) и мелких агрегатов (60%), агрегаты не должны содержать более 10-12 клеток)
среднеагрегированные;
(состоят из одиночных клеток (40%), мелких агрегатов (40%) и крупных агрегатов (20%))
высокоагрегированные;
(состоят из мелких (40%) и крупных агрегатов (60%)
ТИПЫ СУСПЕНЗИОННЫХ КУЛЬТУР:
(в зависимости от степени агрегированности)

КУЛЬТУРЫ ПРОТОПЛАСТОВ

Протопласт – это живое содержимое растительной клетки, лишенное клеточной стенки

ИСТОЧНИКИ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТОПЛАСТОВ:
изолированные органы растений и их части (листья, корни, лепестки);
суспензионная культура;
каллусная ткань.

Основан на механическом разрезании клеточной стенки у клеток в плазмолизированном состоянии
Основан на разрушении клеточной стенки с помощью ферментов
Клеркер (1892)
Кокинг (1960)

МЕХАНИЧЕСКИЙ МЕТОД ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТОПЛАСТОВ

Плазмолиз – явление отделения протопласта растительной клетки от клеточной стенки в гипертонической среде

Схема строения растительной клеточной стенки

На практике часто используются ферментные препараты, включающие комплекс из нескольких гидролитических ферментов
Состав ферментативной смеси должен наиболее полно соответствовать составу клеточной стенки!

Основные компоненты питательных сред для культивирования растительных клеток:
макроэлементы;
микроэлементы;
источник углерода;
витамины;
регуляторы роста

РЕГУЛЯТОРЫ РОСТА РАСТЕНИЙ
Содержание регуляторов роста является определяющим фактором для успешного роста культур клеток растений
АУКСИНЫ
ЦИТОКИНИНЫ

АУКСИНЫ
β-индолил-3-уксусная кислота (ИУК)
β-индолил-3-масляная кислота (ИМК)
α-нафтилуксусная кислота (НУК)
2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-Д)

АУКСИНЫ НЕОБХОДИМЫ ДЛЯ:
стимуляции деления и растяжения клеток каллусных и суспензионных культур;
стимуляции образования корней (ризогенеза);
в сочетании с другими фитогормонами для формирования у протопластов клеточных стенок

Стимуляция закладки корней (ризогенеза) у черенков под действием ауксинов

ИУК способна легко окисляться клетками растений.
Ее редко добавляют в среду для культивирования в качестве единственного ауксина
Синтетические ауксины (2,4-Д, НУК) обладают более высокой биологической активностью по сравнению с природными (ИУК, ИМК)
Например, ИУК в 300 раз менее активна, чем 2,4-Д и в 30 раз менее активна, чем НУК

ЦИТОКИНИНЫ
Зеатин
Изопентениладенин (ИПА)
6-фурфуриладенин (кинетин)
6-бензиламинопурин (6-БАП)

Зеатин термолабилен, поэтому его нельзя автоклавировать

ЦИТОКИНИНЫ ВКЛЮЧАЮТ В СОСТАВ СРЕД ДЛЯ:
стимуляции клеточных делений в каллусных и суспензионных культурах, в культурах протопластов;
образования побегов (стеблевой морфогенез)

ФИЗИЧЕСКИЕ УСЛОВИЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ:
условия освещения;
Каллусные культуры и клеточные суспензии выращиваются либо темноте, либо под лампами белого света.
температура;
Для большинства культур поддерживается в термостатах на уровне 26±1°С.
условия аэрации;
Важны для суспензионных культур. Зависят от эффективности перемешивания питательной среды и подачи стерильного воздуха (в случае культивирования в биореакторах).
влажность воздуха
В культуральной комнате должна составлять 60–70 %

Ростовой цикл каллусных и суспензионных культур