Нуклеиновые кислоты. (Часть 2) презентация

Физико-химические свойства ДНК
Физико-химические свойства ДНК определяются ее структурой.
У ДНК нет 2’ ОН группы, а у РНК – есть
ДНК более устойчива к действию химических веществ и остается стабильной в отсутствие ферментативного катализа
Именно ДНК является хранителем наследственной информации

Оптические свойства ДНК определяются:
Пуриновыми и пиримидиновыми основаниями
Стэккинг-взаимодействиями между азотистыми основаниями
Пурины и пиримидины поглощают в УФ области спектра с максимумом при 260 нм Мах поглощения ДНК при λ = 260 нм
1 единица оптического поглощения соответствует концентрации 50 мкг/мл ДНК
(Оптич.погл. при 260нм / Оптич.погл. при 280 нм)
>= 1,7
Проба ДНК достаточно чиста от примесей белка

Гиперхромный эффект - резкое возрастание поглощения при 260нм при переходе ДНК от дву- к одноцепочечной форме

Денатурация ДНК = Плавление ДНК
Процесс нарушения первичной структуры ДНК, сопровождаемый разрывом двойной спирали
Тпл (Тm) - та температура, при которой разрушается половина водородных связей
От чего зависит Тm ДНК?
1. От длины ДНК
2. От GC-состава
3. От ионной силы раствора
В клетке «плавление» ДНК осуществляет фермент - хеликаза

Ионная сила раствора –
Мера интенсивности электрического поля, создаваемого ионами в растворе
Тm и Ионная сила раствора

Тm и GC-состав ДНК

Формула для расчета Тm

При денатурации ДНК изменяются ее физико-химические свойства
Уменьшается вязкость
Увеличивается плавучая плотность ( положение молекулы ДНК в градиенте плотности хлористого цезия при ультраЦФ)
Происходит гиперхромный эффект

Электрофорез ДНК
В нейтральной и щелочной средах молекулы нуклеиновых кислот заряжены отрицательно.
Отношение заряда к массе одинаково для всех нуклеиновых кислот
Разделение за счет размеров и формы!

Электрофорез НК
В ПААГ
Для фракционирования фрагментов < 1000 bp
В агарозных гелях
Для фракционирования фрагментов от 100 bp до 30000 bp
Пульс-электрофорез (PFGE)
Для фракционирования молекул более 30 – 50 kbp
Между логарифмом электрофоретической подвижности ДНК (μ) и концентрацией геля (τ) существует прямая зависимость:
Lg μ = μ0 - Kr* τ
μ0 – cвободная электрофоретическая подвижность
Kr – коэфф. замедления (зависит от св-в геля, величины и формы движущихся молекул)

Разделение в агарозном геле ДНК одного размера в разных конформациях.
1 – суперспирализованная
11 – релаксированная
1r – промежуточные формы с разным количеством супервитков

Визуализация ДНК
Бромистый этидий
УФ краситель, который интеркалирует между азотистыми основаниями в ДНК. КАНЦЕРОГЕН!
Другие красители, специфичные для ДНК, например, SYBR Green
Радиоавтография

Гибридизация НК
Southern blot
is a method used in molecular biology for detection of a specific DNA sequence in DNA samples.
Соединение in vitro комплементарных одноцепочечных НК в одну молекулу
ДНК-ДНК гибридизация
ДНК-РНК гибридизация
Nothern blot
Метод исследования экспрессии генов путем тестирования м-РНК
Гибридизация in situ FISH
Чтобы разъединить нуклеотидные цепи ДНК прибегают к денатурации (для последующей гибридизации денатурированной должна быть как ДНК в ядрах исследуемого образца, так и сам ДНК-зонд).

Современные подходы к секвенированию ДНК
Техника определения нуклеотидной последовательности ДНК и РНК для получения формального описания её первичной структуры. Технология методов секвенирования нового поколения (СНП) позволяет «прочитать» единовременно сразу несколько участков генома, что является главным отличием от более ранних методов секвенирования. СНП осуществляется с помощью повторяющихся циклов удлинения цепи, индуцированного полимеразой, или многократного лигирования олигонуклеотидов. В ходе СНП могут генерироваться до сотен мегабаз и гигабаз нуклеотидных последовательностей за один рабочий цикл.

Illumina/Solexa – один из методов СНП
Принцип секвенирования путем синтеза
Одноцепочечные фрагменты ДНК закрепляются на твердой подложке.
ДНК-зависимая ДНК полимераза синтезирует комплементарную цепь.
Встраивание каждого нового нуклеотида регистрируется с помощью камеры.
используются 3‘ модифицированные нуклеотиды с присоединенными флюоресцентными метками разных цветов.

Первый секвенатор Genome Analyzer 1G был представлен компанией Solexa в 2006 году. Длина прочтения составляла 30-35 нуклеотида, можно было получить около 1 Gb информации.
HiSeq 2000 (2011 год) способен секвенировать 6 человеческих геномов за 11 дней. Длина прочтения составляет 100 нуклеотидов, можно получить 600 Gb информации
НАИБОЛЕЕ ПРОИЗВОДИТЕЛЬНЫЙ МЕТОД

РНК-секвенирование.Изучение транскриптома.
Современное полногеномное РНК-секвенирование (RNA-seq) основано на прямом секвенировании фрагментов с-DNA
Анализ экспрессии генов

Что мы делали на прошлом занятии и как оно связано с этим?
Выделили плазмидную ДНК
Определили ее концентрацию
Провели рестрикционный анализ выделенной ДНК с помощью рестриктаз EcoR1 и Pstl
Сегодня будем проводить ЭФ для оценки рестрикции. Фрагменты какой длины мы с вами должны будем увидеть?
+ понаблюдаем за способностью ДНК к гиперхромному эффекту.