Регуляция везикулярного транспорта (Лекция 1) презентация

Транспорт макромолекул между клеточными компартментами

Press Release
The Nobel Assembly at Karolinska Institutet
has today decided to award
The 2013 Nobel Prize in Physiology or Medicine
for their discoveries of machinery regulating vesicle traffic, major transport system in our cells
The three Nobel Laureates have discovered the molecular principles that govern how this cargo is delivered to the right place at the right time in the cell.
jointly to James E. Rothman, Randy W. Schekman
and Thomas C. Südhof

Везикулярный транспорт – это перенос макромолекул-грузов, «упакованных» в мембранные пузырьки, или везикулы, от одного мембранного компартмента клетки к другому.
Грузами могут быть как белки, так и липиды
В этом процессе участвуют все мембранные компартменты, кроме митохондрий

Компартмент:
Имеет характерную морфологию, постоянный липидно-белковый состав, выполняет набор определенных функций
существует постоянно ( preexisting) – стабилен
Транспортная везикула:
Несет груз, возникает на мембране компартмента-донора и исчезает после слияния с компартментом-мишенью

Основные стадии транспортного процесса
Мембрана-донор
Акцептор (мишень)
Сборка транспортной везикулы (budding)
транспортировка
нацеливание/узнавание/сближение/ заякоривание
(targeting/recognition/tethering/docking)
Слияние (fusion)
Рециклирование регуляторных транспортных белков
Белки окаймлений (COPI, II, клатрин-зависимые etc.)
Белки-грузы, рецепторы грузов
Регуляторные транспортные белки, обеспечивающие прохождение дальнейших стадий (Rab-белки)
МТ, актиновые структуры
3+4. Rab-белки и их эффекторы, NSF-SNAP-SNARE система
4
3
2
1

Эндоцитозный путь: интернализация, рециклирование, трансцитоз, путь лизосомальной деградации
Ретроградный путь

Эндоцитозный, или ретроградный путь – это путь от плазматической мембраны внутрь клетки
Ранние эндосомы – основная сортирующая станция на эндоцитозном пути
Рециклирование (возврат на ПМ)
Переход в поздние эндосомы (вступление на путь лизосомной деградации)
фагоцитоз
трансцитоз
доставка в TGN

Биосинтетический и секреторный (или экзоцитозный) путь антероградный путь
Лиз
Лиз
Ядро
ЭПР
АГ
СГ
РЭ
ПЭ

Основная часть биосинтетического пути –
от ЭПР к цис-Гольджи, через цистерны Гольджи до транс-сети Гольджи (trans-Golgi network, TGN)
TGN – основная сортирующая станция на биосинтетическом пути
секреция
доставка на апикальную или базолатеральную ПМ
(экзоцитоз)
ранние и поздние эндосомы
лизосомы
другие органеллы

В ходе везикулярного транспорта идет постоянный процесс сортировки компонентов мембран: т.наз.резидентные компоненты удерживаются в мембране органеллы, тогда как компоненты-«грузы» исключаются из нее
пример: аппарат Гольджи
При огромном потоке синтезированных de novo белков, перемещающихся из цис-цистерн в транс-цистерны, сами цистерны сохраняют свою идентичность (т.е. определенный набор белков и липидов)

Брефельдин А – блокирует транспорт из ЭПР в Гольджи, не влияя на транспорт в обратном направлении

Sciaky et al., 1997, JBC 139 (5)
Brefeldin A GFP-GalTase in HeLA
4 sec intervals

Брефельдин А – блокирует транспорт из ЭПР в Гольджи, не влияя на транспорт в обратном направлении
Sciaky et al., 1997, JBC 139 (5)
Brefeldin A GFP-GalTase in HeLA
В присутствии микротрубочек МТ разобраны Нокодазолом

Зачем нужен везикулярный транспорт?
Обеспечение подвижности клетки

Суперсемейство малых ГТФаз
Ras
Rab
Rho
Rac
ARF
Ran
Регулируют
разные
стадии
везикулярного
транспорта
сигналинг
Импорт в ядро

Специфическое взаимодействие с мембраной-мишенью (“tethering”) – первая стадия слияния мембран
или
стимуляция иных клеточных реакций
Малые ГТФазы 20-30 kDa
низкая собственная скорость гидролиза ГТФ
Cell’s “top-managers”

МЕТОДЫ
Микроскопия (флуоресцентная, электронная)
Фракционирование (дифференциальное, в градиентах плотности
Биохимические методы
4. Системы in vitro
Генно-инженерные подходы
Методы системной биологии, моделирование

Генно-инженерные методы :
мутантные формы белков
Нокауты
siRNA
Флуоресцентные методы
Окраска антителами фиксированных клеток
конструкции «белок-GFP»
комплексы лигандов с флуорофорами
(Cy3 Alexa, QDs)

ФИ-3-киназа р85 отвечает на действие ЭФР, но не ко-локализуется с рецептор-содержащими эндосомами.
0 мин
15 мин
60 мин
90 мин
ЭФР-Р р85

15 мин после стимуляции эндоцитоза в клетках А431

Leica TCS SP5

15 мин
30 мин
60 мин
Проблема лимитов разрешения

МТ в фиксированых клетках
МТ в живых клетках
(альфа-тубулин-EGFP)

Электронная микроскопия: тонкая структура, но маленькое поле;
артефакты при обработке
N

17% Перколл
33% Перколл
Фракционирование:
Разделение поздних эндосом и лизосом при центрифугировании в градиенте Перколла

Total membranes
ПМ
Разделение органелл в градиенте Перколла с последующей ЕМ фракций

Степень ассоциации Rab7 c ПЭ коррелирует с эффективностью сортировки рецептора ЭФР

На поздних стадиях эндоцитоза области локализации Rab7 и активно сортирующегося рецептора ЭФР пересекаются
А431
EGFR Rab7
EGFR merge Rab7
10 мин
60 мин ЭФР
180 мин
30 мин
KN
CD126
WT

контроль вортманнин
ТФ-Р
ERD2
контроль
вортманнин
Вортманнин приводит к накоплению в околоядерной области укрупненных везикулярных структур
ЭФР-Р
Клетки А431