Рекомбинантные белки, современные способы получения и свойства презентация

Общий метод получения рекомбинантного белка
Молекулярное клонирование гена или его фрагмента
Трансформация клеток, отбор клонов
Выращивание культуры или организма
Выделение и очистка белка

Молекулярное клонирование

Электропорация
25 мкФ = 2500 В
при 200 Ω за 5 мс

Отбор клонов
protein

Использование рекомбинантных белков
Научные исследования – внесение мутаций, гомогенные ферменты, структурные исследования, слитые белки, антигены и т.д.
Все остальное – биотехнологическое применение

Рекомбинантные белки для лечения заболеваний: особые требования
Высокая степень очистки
Точная копия природного белка или научные доказательства безопасности мутаций для пациентов
Проверенный, стабильный и безопасный продуцент
Как можно более полное удаление ВСЕХ биополимеров и пирогенов продуцента (ДНК <10 пг/мг)
Раствор или порошок, в котором белок полностью сохраняет свои свойства не менее 1 года
Полная демонстрация стабильности, качества и обоснованности процесса получения – GMP (Good Manufacturing Process)

Используемые системы экспресии
Бактерии Esherichia coli и Bacillus subtilis
Дрожжи Saccharomyces cerevisae и Pichia pastoris
Линии клеток млекопитающих CHO, BHK, A-293
Трансгенные животные

Экспрессионный вектор
Точка инициации репликации - ORI
Селекционные маркеры
Промотор целевого гена
Терминатор транскрипции
Полилинкер - MCS

Бактерия Esherichia coli
Быстрый рост (6-12 часов от посева до окончания индукции)
Относительно высокий выход целевого белка (100-2000 мг/л)
Низкая цена ростовой среды (натуральные простые компоненты)
Низкая стоимость ферментации
Возможность получать микрокристаллы целевого белка (тельца включения)
Затруднен биосинтез крупных полипептидов (>50 кДа)
Нет системы гликозилирования
Ограниченные возможности секреции белков
Многие гетерологичные белки токсичны для клеток
Затруднено образование дисульфидных связей
Многие гетерологичные белки образуют только тельца включения
Преимущества Недостатки

E.coli – пример системы экспресии
Внехромосомная репликация вектора
Индуцибельный промотор
Специальный штамм
Дополнительный остаток Met[-1] или лидерный пептид
Блок стоп-кодонов

E.сoli – варианты систем экспрессии

E.coli – примеры использования
Белки
Bactericidal/permeability-increasing Protein,
rDNA
Carboxypeptidase, rDNA
G-CSF, rDNA/Amgen
GM-CSF, rDNA/Schering-Plough
Hyaluronidase, rDNA
Insulin-like Growth Factor-1, rDNA/Tercica
Interferon alfa-2a, rDNA
Interferon alfa-2b, rDNA
Interferon alfacon-1, rDNA
Interferon betaser, rDNA/Berlex
Interferon gamma, rDNA
Interleukin-1ra, rDNA
Interleukin-11, rDNA
Interleukin-2, rDNA/Chiron
Keratinocyte growth factor, rDNA
Somatropin, rDNA/
Somatropin antagonist, rDNA, PEG-
T4 Endonuclease, rDNA, Liposomal
TNF, rDNA
tPA, rDNA/PDL
Urokinase Plasminogen Activator, rDNA
Слитые белки
Interleukin-13–Pseudomonas toxin, rDNA
Interleukin-2/diphtheria toxin, rDNA
Вакцины
Cholera Vaccine (rDNA)/SBL
Staphylococcus vaccine (rDNA)
Anthrax Vaccine, rDNA/VaxGen
Lyme Vaccine, rDNA/Aventis
Pertussis Toxoid, rDNA
Пептиды
Calcitonin, rDNA
Glucagon, rDNA/Lilly
Insulin, rDNA/Lilly
Insulin glargine, rDNA
Natriuretic peptide, rDNA
Parathyroid hormone (1-34), rDNA
Parathyroid hormone (1-84), rDNA
Антитела и фрагменты антител
Complement C5 Mab, rDNA
Heat shock protein Mab Mab, rDNA
TNF Mab Fab', rDNA, PEG-
VEGF Mab Fab, rDNA

Дрожжи Pichia pastoris
Относительно быстрый рост (3-5 дней от посева до окончания индукции)
Высокий выход целевого белка (до 40 г/л)
Очень низкая цена ростовой среды (глицерин, метанол, аммиак)
Умеренная стоимость ферментации
Возможна экспрессия крупных полипептидов (>50 кДа)
Возможно гликозилирование
Секреция белка в ростовую среду, низкий уровень секреции протеаз
N-гликозилирование дает иммуногенные олигосахариды
Не все белки эффективно секретируются
Патентные ограничения на промышленное использование
Преимущества Недостатки

P.pastoris – получение продуцента

P.pastoris – схема ферментации

P.pastoris – примеры использования
Alfimeprase - Accfib; 3-203-fibrolase (3-serine) (Agkistrodon contortrix recombinant)
DX-88; ecallantide; kallikrein inhibitor protein, recombinant

Линия клеток CHO
Пригодна для белков любого размера
Любые пост-трансляционные модификации
Не содержит трансмиссивных вирусов
Существует сублиния DG44, дефектная по гену DHFR (легкая амплификация кассет)
Большое время создания продуцента (до 1 года)
Медленный рост ( промышленное культивирование до 200 дней)
Требует соблюдения полной стерильности и защиты от заражения вирусами
Некоторые ферментные системы пост-трансляционных модификаций имеют ограниченные возможности и требуют оверэкспрессии генов
Ограниченный пролиферативный потенциал (до 25 пассажей)
Дорогая культуральная среда
Преимущества Недостатки

CHO – вариант системы экспресии
Внехромосомная репликация вектора
Индуцибельный промотор
Специальный штамм
Дополнительный остаток Met[-1] или лидерный пептид
Блок стоп-кодонов

Methotrexate (MTX) Selection
Gene of interest DHFR
Transfect
dfhr- cells
Grow in
Nucleoside
Free medium
Culture a
Colony of
cells
Grow in
0.05 uM Mtx
Culture a
Colony of
cells

Methotrexate (MTX) Selection
Grow in
5.0 uM Mtx
Grow in
0.25 uM Mtx
Culture a
Colony of
cells
Culture a
Colony of
cells
Foreign gene
expressed in
high level in
CHO cells

CHO – примеры использования
Гормоны и цитокины
Bone Morphogenic Protein-2, rDNA
Bone Morphogenic Protein-7, rDNA
EPO, rDNA/Amgen
EPO, darb-, rDNA
Corifollitropin alfa, rDNA
FSH rDNA/Schering-Plough
G-CSF, rDNA/Sanofi
Luteinizing hormone, rDNA
Interferon beta-1a, rDNA/Biogen
Insulin-like Growth Factor-1/IGFBP-3, rDNA
Thyroid stimulating hormone, rDNA
hCG, rDNA
Ферменты
Arylsulfatase B, rDNA
DNase, rDNA
Galactosidase, beta rDNA
Glucocerebrosidase, rDNA
Glucosidase, rDNA
Iduronidase, rDNA
Антитела
CD11a Mab, rDNA
CD20 Mab, rDNA
CD20 Mab, rDNA conc.
CD20 Mab, rDNA/Y-90 & In-111 radioconj.
CD52 Mab, rDNA
EGF receptor Mab, human, rDNA/Amgen
HER2 receptor Mab, rDNA
Immunoglobulin E Mab, rDNA
RANKL Mab, rDNA
TNF Receptor-IgG Fc, rDNA
VEGF Mab, rDNA
CTLA4-Ig, rDNA
LFA-3/IgG1, rDNA
Система свертываемости крови
Factor IX, rDNA/Wyeth
Factor VIII, rDNA/Baxter
Factor VIII BDD, rDNA, PFM
tPA, rDNA/Genentech
tPA, TNK-, rDNA
Thrombin, rDNA