Введение в протеомику презентация

План курса
Структурно-функциональные основы протеомики
Методы разделения белков:
хроматография
электрофорез
Методы идентификации белков
Масс-спектрометрия
Методы установления пространственной структуры белков
Базы данных в протеомике
Интерактомика и протеомика
Клиническая протеомика

Литература к курсу

План лекции
Многообразие белков
Строение и функционирование белков в клетке
Предпосылки возникновения протеомики
Протеомика как постгеномная дисциплина
Инструментарий протеомики
Приложения протеомики

1. Многообразие белковых соединений
Белки различаются по:
СТРУКТУРЕ,
СВОЙСТВАМ
ФУНКЦИЯМ

Структура белков
Аминокислотная
последовательность
Вторичная структура
Третичная структура
Четвертичная структура

Свойства белков
Белки различаются:
По размеру
По заряду (изоэлектрической точке)
По растворимости в воде

Размер белковой молекулы
Средний размер молекулы белка у дрожжей
466 аминокислотных остатков – 53 000 а.е.м.
Титин — компонент саркомеров мышц, самый большой из известных полипептидов
34350 аминокислотных остатков – 2 993 442.763 а.е.м.
Размер белков коррелирует с молекулярной массой, которая обычно выражается в кДа, 1 кДа=1000 а.е.м.
C132983H211861N36149O40883S693

Заряд белковой молекулы
Белки - амфотерные полиэлектролиты
Заряд определяется двумя параметрами:
рН среды и изоэлектрическая точка
Изоэлектрическая точка
в основном - 5,5 до 7,0,
значения лежат в экстремальных областях для специализированных белков:
пепсин - pI ~ 1, желудочный сок
сальмин - pI ~ 12, протамин молок лосося (высокое содержание аргинина)
Белки, связывающиеся с нуклеиновыми кислотами за счёт электростатического взаимодействия с фосфатными остатками нуклеиновых кислот, часто являются основными белками. Примером таких белков служат гистоны и протамины.

Растворимость в воде
Большинство белков – растворимы в воде.
Нерастворимые белки: кератин и фиброин.
гидрофильные и гидрофобные.
Гидрофильные – большинство белков цитоплазмы, ядра и межклеточного вещества, в т.ч. нерастворимые кератин и фиброин.
Гидрофобные - большинство белков, входящих в состав биологических мембран интегральных мембранных белков, которые взаимодействуют с гидрофобными липидами мембраны (есть и небольшие гидрофильные участки).
Для извлечения гидрофобных белков из мембраны используют метод солюбилизации детергентами.

«Жизненный цикл» белка

Функциональные семейства белков
Venter et al. (2001) Science 291:1304–1351

Функционально белки связаны между собой в рамках отдельных метаболических путей
Метаболические белки – катализаторы химических реакций
Сигнальные белки – участвуют в передаче сигнала.
Регуляторные – специфически контролируют скорость химических реакций или поступления веществ в клетку
Структурные
Транспортные
Двигательные
ДНК и РНК связывающие
Защитные

Основной метаболизм – 15%
Структурные белки и синтез белка – 15-20%
цитоскелет, рибосомальные белки, шапероны, белки протеосомы
Сигнальные и ДНК-связывающие белки – 20-25%
Функция неизвестна – 40%
Функциональная геномика – поиск функций неизвестных генов
Гены и геномы
Гомологичные последовательности называют ортологичными, если к их разделению привел акт видообразования: если ген существует у некоего вида, который дивергирует с образованием двух видов, то копии этого гена у дочерних видов называются ортологами. Гомологичные последовательности называют паралогичными, если к их разделению привело удвоение гена: если в пределах одного организма в результате хромосомной мутации произошло удвоение гена, то его копии называют паралогами.

Гены и количество экспрессируемого белка
Кол-во молекул белка в клетке - 10-106
Экспрессируется 30-80% от возможных продуктов генома
Кол-во белка в клетке зависит от нескольких факторов:
Скорость транскрипции
Скорость трансляции
Скорость деградации белка
Используемость кодонов

Посттрансляционная модификация — это химическая модификация белка после его трансляции. Это одна из последних стадий процесса биосинтеза белка для многих белков.
ацетилирование
фосфорилирование
гликозилирование
изменение природы аминокислоты
метилирование
протеолиз

Белки – «модульные» соединения
Домен – часть белковой молекулы, имеющая собственную
3D структуру.
Независимая структурная единица.
Может эволюционировать независимо от остального белка
На основании доменной структуры белки подразделяются на семейства
Примеры доменов: Zn-пальцы, домены иммуноглобулинов

Масштабные направления
геномика - геном
транскриптомика - транскриптом
метаболомика - метаболом
цитомика - цитом
пептидомика - пептидом

Зачем нужна протеомика?
Геном - Транскриптом - Протеом
Несколько уровней регуляции ген-функция
Белки – молекулы, реализующие физиологический эффект
из: Graves and Haystead, 2002
Одни и те же гены, но...

Протеомика , БГУ 2011

Протеомика , БГУ 2011

2.Что такое протеом?
Протеом — множество всех белков биообъекта в данный момент времени.
"PROTEins" и "genOMe"
Клеточный протеом – все белки определенной клетки на конкретной стадии дифференцировки, развивающейся в определенных условиях.
Гепатоцит (клетка печени) содержит 10000-20000 различных белков, каждый из которых может находиться в количестве 20 тыс. – 100 млн. копий на одну клетку.
Протеом гепатоцита имеет массу 0,5 нг, что составляет 18-20 % от общей массы клетки.
Общий протеом организма - весь набор белков конкретного организма в данный момент времени, и в том числе объединяет различные клеточные протеомы.
Один и тот же организм может иметь различный протеом в зависимости от стадии жизненного цикла, окружающих условий среды и т.д.
Протеом человека включает в среднем 2 миллиона различных белков, каждый из которых имеет свою структуру и обладает различными функциями.

Задачи протеомики
1) идентификация белков
2) количественное определение белков
3) дифференциальный анализ
4) анализ белок-белковые взаимодействий (с интерактомикой)
5) установление характера посттрансляционных модификаций
6) структурный анализ белков протеома
7) экспериментальная биоинформатика в области протеомики (создание и усовершенствование существующих экспериментальных и биоинформационных методов и выявление новой информации и создание новых баз данных о белках)
7) поиск биомаркеров патологических процессов
8) установление механизмов возникновения заболеваний на молекулярном уровне
Цель протеомики - идентификация, характеристика и количественный учет ВСЕХ белков метаболического пути, органеллы, клетки, ткани, органа и всего организма.
Протеомика: цель и задачи
Объект исследования - протеомы

Протеомика
Протеомика конкретных биообъектов
протеомика плазмы крови,
протеомика микроорганизмов
протеомика новообразования
Протеомика как методология

Протеомика и геномика
Полностью изучен ряд геномов, но до сих пор полностью не охарактеризован ни один эукариотический протеом

Протеомика и химия белка

Кто занимается протеомикой
2001 Международная организация по изучению протеома человека (Human Proteome Organization / HUPO).
Journal of Proteome Research
(January 4, 2013, Volume 12, Issue 1)
Интеграция и обработка данных в швейцарском институте биоинформатики (SIB), Женева
Деятельность: реализация проекта «Протеом человека» (HPP)
«Хромосомный» подход к протеомике

Инструментарий протеомики

Методы протеомики
Методы разделения белков
Методы идентификации белков
Методы количественного анализа белков
Методы накопления, хранения и обработки полученной информации

Методы разделения
SDS-электрофорез в полиакриламидном геле
Изоэлектрическое фокусирование
Двумерный электрофорез
Хроматография

Методы идентификации белков
Масс-спектрометрия
Иммуноблоттинг

Обработка информации - биоинформатика
Биоинформатика - использование математических средств для извлечения полезной информации из «шумных» или слишком объёмных данных о структуре ДНК и белков, полученных экспериментально.
Биоинформа́тика
математические методы компьютерного анализа в сравнительной геномике (геномная биоинформатика).
разработка алгоритмов и программ для предсказания пространственной структуры белков (структурная биоинформатика).
исследований стратегий, соответствующих вычислительных методологий, а также общее управление информационной сложности биологических систем.
Биоинформатика помогает связать геномные и протеомные проекты, к примеру, помогая в использовании последовательности ДНК для идентификации белков.

2D-гель электрофорез и масс-спектрометрия способны дать качественную и количественную информацию о поведении отдельных белков
наиболее часто используемый подход в протеомном анализе
from: Pandey and Mann, 2000
Дифференциальная экспрессия генов

Клиническое и биомедицинское применение протеомики
Клинические применения 2-D PAGE & MS
Идентификация происхождения образцов жидкостей организма и образцов тканей, полученных биопсией.
Анализ белковых фенотипов и посттрансляционных модификаций в жидкостях, клетках или тканях.
Изучение клональности иммуноглобулинов и определение клонов, которые не могут быть определены обычными методами.
Наблюдение за процессом течения болезни и экспрессией белков.
Определение новых биомаркеров болезней и/или шаблонов в клетках и тканях.

Клиническое применение
2-D электрофореза
Физиологические жидкости
Клетки крови
Плазма и сыворотка
Моча
Цереброспинальная жидкость
Амниотическая жидкость
Синовиальная жидкость
Слюна
Пот
Слезная жидкость
Твердые ткани
Сердце
Мозг
Щитовидная железа
Мышца
Злокачественые опухоли
Культура тканей
Малигнизированные клетки
Бактериальные белки
Young & Tracy Journal of Chromatography A, 698 (1995) 163-179

Прикладная протеомика
Поиск и обнаружение биомаркеров
Установление молекулярных механизмов возникновения заболеваний
Ранняя диагностика заболеваний
Аннотация геномов
Эволюционный анализ Идентификация видовой принадлежности

Биомаркеры
NIH, 2001
Биомаркер — это характеристика, которую можно объективно измерить, и которая может служить в качестве индикатора физиологических и патологических биологических процессов или фармакологических ответов на терапевтическое вмешательство.
Биомаркер (биологический маркер) – это исследуемый параметр, измерение которого отличается высокой точностью, надежностью и воспроизводимостью, что позволяет отражать напряженность физиологических процессов, состояние здоровья, степень риска или факт развития заболевания, его стадию и прогноз.
Биомаркер – это характеристика (биологический признак), которая используется в качестве индикатора биологического состояния всего организма.

Использование биомаркеров
Прогнозирование индивидуального риска заболеваний у здоровых лиц.
Оценка нормальных физиологических процессов в организме (рост, вес, спортивная форма, протекание беременности, старение).
Выявление заболеваний, подбор лечения, оценка его эффективности.
Прогнозирование течения и исхода заболевания.
Определения негативных эффектов внешней среды, в том числе химических отравлений, радиационного облучения и др.
Разработка новых лекарственных средств.

Виды биомаркеров
• Предупредительные
Используются для выявления лиц с повышенным риском возникновения заболевания по уровню содержания в организме тех или иных веществ.
Высокий уровень ЛПНП может указывать на высокий риск развития атеросклероза.
• Верификационные
Подтверждающие заболевания на субклинической стадии.
Микроальбуминурия появляется у лиц с сахарным диабетом ещё до того, как появятся первые клинические проявления.
• Диагностические биомаркеры
Используются для идентификации определенного заболевания.
Повышение концентрации тропонина в крови указывает на инфаркт миокарда, а гликолизированного гемоглобина — на сахарный диабет.
• Биомаркеры состояния
Используются для определения тяжести заболевания.
Мозговой натрийуретический пептид — для определения функционального класса застойной сердечной недостаточности.
• Прогностические.
Используются для оценки прогноза развития заболевания, его возможного исхода и оценки эффективности лечения. Например, биомаркеры рака при опухолях или гликозилированный гемоглобин при диабете.
• Фармакодинамические биомаркеры.
Используются при разработке лекарств и выявляют определенный фармакологический ответ, что необходимо при исследованиях по оптимизации дозировок лекарств.

Протеомика и разработка лекарств будущего
Пауль Эрлих (начало 20 в.):
Концепция мишени