Серологические маркеры парентеральных вирусных гепатитов: диагностическая значимость и интерпретация результатов презентация

Динамика заболеваемости острым гепатитом В, хроническим
гепатитом В и носительства гепатита В, на 100 000 населения *)

ООО «НПО «Диагностические системы», 2017г
Диагностика оккультного гепатита В и выявление мутантных форм HВsAg

Латентная HBV инфекция
Низкий уровень репликации HBV,
сниженный синтез и экспрессия
вирусных антигенов.
Адекватный ответ иммунной системы,
ингибирующее воздействии других
вирусов
(HCV, HDV, HIV)
Репликация вируса
не подавлена,
но не выявляется
современными тест-системами
вследствие мутаций, изменяющих
структуру его основных детерминант
Occult hepatitis B
virus infection

Клинический случай № 1
Пациент, мужчина, 20 лет, не злоупотребляющий алкоголем. Поступил в стационар с признаками асцита.
Результаты обследования:
Билирубин - 41 моль/л, АлАТ – 131 МЕ/л, АсАТ- 194 МЕ/л, щел. фосфатаза - 125 МЕ/л, сывороточный альбумин - 20 г/л, протромбиновое время - 12.5 с. (кон-ль:10с.), сывороточно-асцитический градиент альбумина-3 г/л, АФП – 50,4 нг/мл.
HBsAg – отриц.
Анти-НСV – отриц.
антиHBs – отриц.
антиHBcor M,G – отриц.
УЗИ брюшной полости показало: эхоструктура паренхимы печени грубая (неравномерно повышенная эхогенность). При эндоскопии верхнего отдела ЖКТ никаких изменений выявлено не было.
С помощью ПЦР выявлена ВГВ-ДНК 8×104 копий/мл.
Окончательный диагноз: цирроз печени.
Al-Mahtab M., Khan M., Rahman S. Department of Hepatology, Bangabandhu Sheikh Mujib Medical University, Dhaka, Bangladesh
Пациент, мужчина, 19 л., не злоупотребляющий алкоголем. Поступил в стационар с синдромом желтухи. При обследовании обнаружили гепатоспленомегалию.
Анализ крови:
гемоглобин: 14 г/дл, лейкоциты: 7000, общий холестерол – 180 мг/дл, LDL – 125 мг/дл, триглицерид – 45 мг/дл и HDL=40 мг/дл. Билирубин – 82 ммоль/л, АлАТ – 71 МЕ/л, АсАТ – 64 МЕ/л, щел. фосфатаза – 185 МЕ/л, сывороточный альбумин – 35 г/л протромбиновое время – 16 c. (control: 12 sec.). АФП – 15,8 нг/мл.
HBsAg – отриц.
Анти-HCV – отриц.
Анти-HBc – отриц.
Анти-HBs – положит.
Проведенная биопсия позволила диагностировать фиброз печени.
С помощью ПЦР выявлена ВГВ-ДНК 4×107 копий/мл.
Окончательный диагноз: цирроз печени с портальной гипертензией.
Клинический случай № 2

Проблема латентной (оккультной) HBV инфекции
0.1%–2.4% среди доноров крови в странах Европы и США.
(Hollinger, F.B.; Hepatitis, B. Virus infection and transfusion medicine: Science and the occult. Transfusion 2008, 48, 1001–1026.)
7.5%–16% в общей популяции в странах Юго-Восточной Азии.
(Fang, Y.; Shang, Q.L.; Liu, J.Y.; Li, D.; Xu, W.Z.; Teng, X.; Zhao, H.W.; Fu, L.J.; Zhang, F.M.; Gu, H.X. Prevalence of occult hepatitis B virus infection among hepatopathy patients and healthy people in China. J. Infect. 2009, 58, 383–388).
Данные о распространенности оккультной HBV инфекции варьируют в зависимости от региона, специфичности и чувствительности рутинных серологических и NAT тестов

Динамика маркеров гепатита В при
остром и хроническом течении инфекции
Время
Инкубация
Окончание
инкубации
Начало
разгара
Начало
разгара
Разгар
Активация
сероконверсии
Перелом
заболевания
Окна
Начало
Выздоров-
ления
Выздоров-
ление
4-12
нед
1-2
нед
2 нед – 3 мес
3 – 6 мес
Годы
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Маркеры
HBeAg
HBsAg
Anti-HBc IgM
Anti-HBc
Anti-HBe
Anti-HBs
HBsAg
HBeAg
Anti-HBc IgG
Anti-HBe
Anti-HBc IgM
Anti-HBs
0.01ME/ml

Оккультный гепатит идентифицируется не инвазивными и рутинными тестами, но результаты часто игнорируются
Оккультная инфекция не идентифицируется рутинными тестами

Проблема латентной (оккультной) HBV инфекции
2004 г. HBV ДНК “+” HBsAg “-” с/без антиHBs[1]
2006 г. HBV ДНК (ткани печени) “+”, HBV ДНК (кровь) “-”, HBsAg “-” [2]
2008 г. Присутствие HBV ДНК в ткани печени (в некоторых случаях в сыворотке крови) в низкой концентрации ≤ 200 МЕ/мл, HBsAg “-”.
Два варианта оккультного ГВ:
серопозитивный (HBcorAb ± HBsAb)
серонегативный (Ab не выявляются).
«Ложно» оккультный ГВ: Репликация вируса не подавлена
(HBV ДНК > 200 МЕ/мл), но не выявляется современными тест-системами вследствие мутаций в пpe-S/S гене, кодирующем белки вирусной оболочки в т.ч. HBsAg. [3]
[1] Allain JP, Transfus Clin Biol, 2004 Feb; 11(1):18-25, [2] Carreno V., World J Gastroenterol,2006, [3] Statements from the Taormina expert meeting on occult hepatitis B virus infection., European Association for the Study of the Liver. Published by Elsevier B.V.

Схема строения вируса
M 133 T
Т 118 R
St 116 ns

Соответствие нейтрализующих
антител к HBsAg дикого
и мутантного типа

«Мутантные формы вируса гепатита B могут возникать у пациентов под воздействием иммунного ответа или лечения. Мутантные формы, которые возникают в иммунодоминантных эпитопах HBsAg, позволяют вирусу размножаться при наличии нейтрализующего иммунного ответа.
В некоторых тест-системах мутантные формы HBsAg определяются как ложно-негативные. Изучение реактивности тест-систем с мутантными формами вируса гепатита B – ключ к установлению правильного алгоритма тестирования на вирус гепатита B»
Paul F. Coleman*
*Abbott Laboratories, Abbott Park, Illinois, USA
По материалам CDC (Центра по контролю и профилактике заболеваний, г. Атланта, США).

«ДС-ИФА-HBsAg-0,01»
ИММУНОФЕРМЕНТНАЯ ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ HBsAg С ПОВЫШЕННОЙ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬЮ к HBsAg,
равной 0,01 МЕ/мл

Международные требования, предъявляемые к тестам для выявления HBsAg

Минимальные требования CTS (Common Technical Specification – Общие технические условия), и количество образцов, на которых была аттестована система ДС-ИФА-HBsAg-0,01

Prüflabor für In-vitro Diagnostika
beim Paul-Ehrlich-Institut (PEI-IVD)
Paul-Ehrlich-Straße 51-59
D-63225 Langen
Evaluation Report for DS-EIA-HBsAg-0,01
Manufacturer:
Diagnostic Systems Ltd.
22 Yablonevaya
603093 Nizhniy Novgorod
Russian Federation
Dr. Heinrich Scheiblauer
Phone: [phone]
Fax: [phone]
E-mail: schhe @pei.de
Results
Seroconversion Sensitivity
To assess early seroconversion sensitivity of the DS-EIAHBsAg-0,01 and for completion of the
CTS study, 31 commercial seroconversion panels were investigated. The results of the individual
panels are given in Appendix 1 Table 6 Part A and Part B.
Results were compared to data available at PEI of further state of the art CE-marked HBsAg
assays listed in Table 3. The DS-EIA-HBsAg-0,01 detected 8 panels (PHM 914, PHM 927, PHM
928, PHM 934, 6272, 6273, 6274 and 11011) reactive in the same bleed as the most sensitive
assay from Table 3. Ten panels (PHM 925, PHM 926, PHM 929, PHM 931, PHM 933, 6275,
11000, 11009, 11012 and 11016) were detected one bleed earlier, 11 panels (PHM 916, PHM
930, 6271, 6279, 11001, 11002, 11003, 11006, 11007, 11008, 11017) two bleeds earlier and
two panels (PHM 919 and PHM 932) even three bleeds earlier than any other HBsAg assay for
which comparative data was available. Comparative results are summarized in Table 4. In Table
4 assays 1-21 are ranked according to their sensitivity. For each panel the DS-EIA-HBsAg-
0,01 results are compared the earliest detection by any of the assays.
Taken together the results demonstrate that the DS-EIA-HBsAg-0,01 is by far the most sensitive
HBsAg test investigated at the Paul-Ehrlich-Institut (Fig. 1). On average the DS-EIAHBsAg-0,01 detected HBsAg 1.35 bleeds (or 5.0 days) earlier than the most sensitive assay and onaverage 3.32 bleeds (or 14.1 days) earlier than the least sensitive assay.
Таким образом, «ДС-ИФА-HBsAg-0,01» - наиболее чувствительный тест, который когда-либо тестировался в институте Пауля-Эрлиха. В среднем, «ДС-ИФА-HBsAg-0,01» определял HBsAg на 5 дней раньше, чем самый чувствительный тест и, в целом на 14 дней раньше, чем наименее чувствительный.

For six seroconversion panels DS‐EIA‐HBsAg‐0.01 assay detected HBsAg seroconversion on average
1.3 specimens earlier than the benchmark assay (Monolisa Ag HBs Plus [Bio‐Rad Laboratories]). For
the low titer panel, DS‐EIA‐HBsAg‐0.01 correctly classified all specimens.
For the WHO International Biological Reference Preparation for Hepatitis B surface antigen [NIBS
code 5086/08], DS‐EIA‐HBsAg‐0.01 detected the 0.13IU/mL. Hepanostika HBsAg ULTRA also detected
to 0.13 IU/ml.
Анализ шести сероконверсионных панелей в DS-EIA-HBsAg-0,01 показал, что данный тест обнаруживал HBsAg в среднем 1,3 образца раньше, чем эталонный тест (Monolisa Ag HBs Plus [Bio-Rad Laboratories]). При анализе панельных образцов с низкими титрами HBsAg, В «DS-EIA-HBsAg-0,01» были правильно классифицированы все образцы.
В Международном биологическом эталонном препарате для поверхностного антигена вируса гепатита В [NIBS code 5086/08], DS-EIA-HBsAg-0,01 обнаружил 0,13 МЕ/мл., тест Hepanostika HBsAg ULTRA также обнаружил 0,13 МЕ/мл.

Согласно требованиям ведущих международных организаций, работающих в области здравоохранения (ВОЗ, PEI), оценка чувствительности тестов, применяемых для скрининга донорской крови, должна оцениваться в первую очередь с применением
- Сероконверсионных панелей
- Панелей нативных образцов, полученных от пациентов, содержащих различные мутантные формы HBsAg

НВsAg native mutants in CDP Plasma (Trina Code: DH1200)

Конъюгат-1:
анти-HBsAg-биотин
Монокло-нальные антитела к HBsAg
+
ПХ
Стр
стрептавидин-пероксидаза хрена
+
+
+
Стр
ПХ
Субстрат:
H2O2 + ТМB
Окрашенный продукт
HBsAg
Биотин
Биотин
Биотин
СХЕМА РЕАКЦИИ

ДС-ИФА-HBsAg-0,01
Единственная Российская тест-система сетифицированная по EC, рекомендованная ВОЗ и институтом Пауля-Эрлиха для диагностики вирусного гепатита В и скрининга донорской крови

Скрининг на анти-HBc: делать или не делать?
Аргументы «за»:
Период “core window” – второе серологическое окно
Давняя HBV инфекция после проведенной терапии и элиминация анти-HBs
Хроническая HBV инфекция с низкой вирусной нагрузкой
Заражение мутантными штаммами вируса гепатита В
Совместное инфицирование HBV/ HIV и HCV.
Аргументы «против»:
Большее количество неспецифических реакции по сравнению с тестами на другие маркеры
Как интерпретировать?
Известны случаи передачи HBV инфекции от “anti-HBcore alone” матери к ребенку и от “anti-HBcore alone донора к реципиенту!

НАСКОЛЬКО АКТУАЛЬНА ДИАГНОСТИКА анти-HBc?
1. Канада, Иран
2. Индия

«…Частота выявления только анти-HBc напрямую связана с распространенностью ВГB-инфекции.
К примеру, среди доноров в районах с низкой распространенностью инфекции эта цифра составляет от 0,4 до 1,7%, а в эндемичных районах отдельные (изолированные) анти-HBc встречаются в 10-20% случаев. Эта цифра также будет высокой среди определенных групп населения (лиц с хронических Гепатитом C, ВИЧ-инфекцией и употребляющих инъекционные наркотики) даже не в эндемичных регионах.»
(на основе 13 источников). Интерпретация изолированных антител к core-антигену ВГB
(Jeanne Marrazzo, MD, MPHChia C. Wang, MD, MS).
Вашингтонский университет, 2006

Скрининг на анти-HBc
Скрининг обязателен:
США
Япония
Франция
Страны Латинской Америки (Бразилия, Уругвай, Колумбия)
Отдельные регионы России

Диагностика Вирусного Гепатита С с помощью тест-системы для одновременного определения Антигена и Антител к HCV
ООО НПО Диагностические Системы

Динамика заболеваемости острым гепатитом С, хроническим гепатитом С, на 100 000 населения *)

Вирус Гепатита С
HCV, одноцепочечный РНК вирус принадлежащий семейству Flaviviridae
Определно 6 главных генотипов (1-6) и несколько субтипов вируса
Генотипы 1-3 встречаются повсеместно
Генотипы 4 и 5 встречаются преимущественно в Африке
Генотип 6 встречается в Азии
Immunology and Cell Biology: “Host and viral factors in the immunopathogenesis of primary hepatitis C virus infection”, Andrew R Lloyd,A, et al.

Введение тестирования с использованием технологий по определению нуклеиновых кислот (NAT) позволяет и дальше уменьшать период окна
ПЦР тесты не являются скрининговыми для доноров в силу ряда ограничений их использования

Тесты для диагностики Гепатита С
ИФА
Доступная цена
Высокая чувствительность
Простота постановки
Ложно-позитивные результаты
Аутоиммунные процессы
Ложно-негативные
Период «окна»
Хроническая иммуносупрессия (пациенты после трансплантации органов, с хронической почечной недостаточностью на диализе, ВИЧ-позитиивные) (Patel et al., 2006)
NAT
Высокая чувствительность
Практически нет периода «окна»
Прямая детекция патогена
Материально-техническое
обеспечение (длительность проведения анализа,
необходимость дополнительного оборудования,
высокая квалификация персонала)
Низкое соотношение цены теста к результату.
Ложно-негативные результаты
Низкая вирусная нагрузка
Мутации в праймерах и в областях связывания праймера с пробой (Seifried et al., 2011)

2010 – Компания ООО НПО Диагностические системы подписала соглашение о совместной работы с Центром по контроля и предотвращению заболеваний (США, Атланта) CRADA Reference NCHHSTP-08-327-00 по разработке теста для одновременного определения в крови антигена и антитела вируса гепатита С
2011 – набор ДС-ИФА-HCV-АГАТ зарегистрирован в МЗ России
ДС-ИФА-HCV-АГАТ

Динамика маркеров ВГС

Реактивность Комбо-тестов в сероконверсионных панелях Zeptometrix 10029, 10023, 10020, 10008 – негативных на анти-ВГС

Корреляция вирусной нагрузки и ОП/ОПкрит в «ДС-ИФА-HCV-АГАТ» в период серологического окна
Для 6 сероконверсионных панелей (9041, 9044, 9045, 9047, 6213, 10062)
Для сероконверсионной панели 6222

ДС-ИФА-HCV-АГАТ
Формат теста:
50 мкл конъюгата 1 (анти-кор Маб меченые биотином) + 50 мкл образца
30 мин 37°C, шейкер
100 мкл конъюгата 2 (стрептавидин-Пх + анти-Human-IgG-Пх)
30 мин 37°C, шейкер
100 мкл ТМБ
20 мин КT
Общее время анализа 1 ч 20 мин

УТВЕРЖДЕНЫ
постановлением Правительства
Российской Федерации
от 31 декабря 2010 г. № 1230
Правила и методы исследований и правила отбора образцов донорской крови, необходимые для применения и исполнения технического регламента о требованиях безопасности крови, ее продуктов, кровезамещающих растворов и технических средств, используемых в трансфузионно-инфузионной терапии
11. При определении маркеров вирусов иммунодефицита человека, гепатитов В и С и возбудителя сифилиса необходимо соблюдать следующие правила:
…
Допускается проведение исследования с целью одновременного определения наличия антител к вирусу гепатита С и антигена вируса гепатита С;

ДС-ИФА-HCV-АГ
Суммарное время инкубации
– 1час 15 мин (шейкер),
Срок годности – 13 месяцев

Общая цель Плана действий – к 2030 г. добиться элиминации вирусных
гепатитов как угрозы общественному здоровью в Европейском регионе путем
снижения заболеваемости и смертности