Слайд 2Электронная микрофотография мембранных органелл
Слайд 4Организация биосинтеза белка у эукариот
Свободные полирибосомы синтезируют белки цитоплазматические, ядерные и некоторых органелл
(митохондрий, хлоропластов, пероксисом).
Рибосомы на мембране ЭПР синтезируют большинство мембранных (интегральных и полуинтегральных) белков и секретируемых белков.
Постсинтетические стабильные преобразования белков (гликозилирование, ацетилирование и проч.) последовательно происходят в просвете ЭПР и внутри цистерн аппарата Гольджи.
Окончательная укладка белковых молекул происходит в местах их конечной адресации.
Слайд 5Визуализация трансляции
ЭМ выделенных полирибосом, напыление металлом.
Слайд 6Полирибосомы и гранулярная эндоплазматическая сеть
Слайд 8Адресация белков в клетке
Белки переносятся внутри клетки в составе мембранных пузырьков или отдельными
молекулами. В последнем случае для правильной адресации им необходимы так называемые сигнальные последовательности.
Длина сигнальной последовательности составляет от 5 до 30 аминокислот. Она может быть гидрофильной или гидрофобной (экспорт из ядра, транспорт в ЭПР). Сигнальная последовательность располагается, как правило, на N-конце, и может отщепляться после прохождения белка через мембрану.
Сигнальные последовательности узнаются специальными рецепторами, расположенными на поверхности органеллы.
Заряд сигнальной последовательности различен. Положительный – транспорт из цитозоля в ядро и митохондрии или отрицательный – транспорт внутрь ЭПР.
Слайд 9Эндоплазматическая сеть в живой клетке - флюоресценция
Весь ЭПР имеет единое внутреннее пространство (для
белков).
Домены в составе ЭПР: ядерная оболочка; гладкий ЭПР;
гранулярный ЭПР; тубулярная система; области контакта с другими органеллами.
Слайд 10Общая схема ЭПР
Мембраны ЭПР образуют извитую сеть и длинные тонкие (50-100 нм в
диаметре) трубочки. Через специальные (адапторные) белки ЭПР контактирует с большинством органелл (ядро, митохондрии, комплекс Гольджи, плазматическая мембрана).
Слайд 11Основные функции ЭПР
Биосинтез белков (в основном – секретируемых и мембранных) – гранулярный ретикулум.
Первичная посттрансляционная модификация синтезированных белков (гликозилирование).
Биосинтез фосфолипидов и формирование мембран (весь ретикулум).
Транспорт веществ внутри ретикулума к местам назначения (в основном – гладкий ретикулум).
Регуляция уровня кальция в цитозоле (депо ионов Са++) – гранулярный и гладкий ретикулум, специализированный гладкий ретикулум (Т-система) в мышечных клетках.
Слайд 12Биосинтез секретируемых и мембранных белков
Биосинтез секретируемых белков начинается также, как остальных – на
рибосоме в цитозоле.
Начальный пептид, связываясь с рибосомой, блокирует дальнейшую трансляцию.
Трансляция (элонгация полипептидной цепи) возобновляется только после связывания рибосомы с транслоконом на мембране ЭПР.
Новосинтезированный белок укладывается в мембране или попадает в просвет ЭПР.
Мембранные и секретируемые белки часто претерпевают посттрансляционную модификацию (гликозилирование и др.) , которая начинается уже в просвете ЭПР.
Слайд 13Биосинтез секретируемого белка
Четыре стадии – до контакта с мембраной (трансляция начального пептида и
ингибирование трансляции узнающим комплексом - SRP); образование комплекса рибосомы с транслоконом и рецептором SRP на мембране ЭПР; продолжение трансляции после прикрепления рибосомы к мембране; завершение трансляции и высвобождение узнающего комплекса.
Частицы SRP аналогичны у бактерий, архей и эукариот.
Слайд 14Биосинтез сложного трансмембранного белка
Слайд 15Модификация белков в ЭПР
Гликозилирование по аспарагину вблизи N-конца. Добавляется блок из 14 остатков
сахаров, которые переносятся в просвет ЭПР олигосахарилтрансферазой. Этот олигосахарид начинает трансформироваться в составе молекулы белка уже в ЭПР и продолжает трансформироваться в аппарате Гольджи.
Прикрепление гликозилфосфатидил инозитола в С-концу полипептида (для связывания с мембраной). При этом трансмембранный полипетид может отрезаться от зрелой молекулы белка, который становится полуинтегральным.
Слайд 16Гликозилирование белка в ЭПР
Первая стадия: переносчик – долихол фосфат, который достаточно гидрофобен.
Слайд 18Биосинтез и перенос фосфолипидов
Основная масса фосфолипидов и их предшественников синтезируется в ЭПР, часть
фосфолипидов – во внутренней мембране митохондрий.
В ЭПР синтезируются: фосфатидная кислота, фосфатидил-холин, фосфатидилсерин, сфингомиелин
В митохондриях из предшественников, поступающих из ЭПР, синтезируются: кардиолипин, фосфатидил-этаноламин
Перенос фосфолипидов между ЭПР и митохондриями осуществляется через специализированные контакты мембран.
Перенос фосфолипидов между органеллами в основном осуществляется без участия мембранных пузырьков. Механизмы транспорта изучены плохо.
Слайд 20Аппарат Гольджи, серебрение нейронов
Слайд 21Аппарат Гольджи, флуоресцентная микроскопия
В клетках животных АГ, как правило, сосредоточен вокруг ядра. В
клетках растений – как правило, отдельные диктиосомы расположены вокруг ядра и вдоль поверхности клетки.
Слайд 23Аппарат Гольджи: крио ЭМ (томография)
Цистерны в диктиосоме могут контактировать друг с другом.
Шкала – 50 нм, расстояние между виртуальными срезами – 80 нм, толщина срезов 1,6 нм.
Слайд 24Структура аппарата Гольджи
Единица комплекса Гольджи – стопка плоских цистерн - диктиосома. К каждой
диктиосоме примыкают цис-Гольджи и транс-Гольджи мембранные сети.
Цистерны не имеют анастомозов, расположенных поперек диктиосомы, но могут соприкасаться друг с другом. Химические реакции внутри цистерн различаются.
Средний размер диктиосомы – 6-10 цистерн. Диаметр – около 1-3 мкм.
Цистерны постоянно обновляются – проксимальная формируется за счет слияния пузырьков, приходящих из ЭПР, дистальная распадается за счет отшнуровки пузырьков, уходящих от нее.
Дополнительный обмен между цистернами внутри стопки происходит в основном с помощью транспортных пузырьков. Также возможно, что цистерны перемещаются в диктиосоме целиком по мере своего созревания.
Слайд 25Поляризация внутри диктиосомы
Строение диктиосомы: цис-компартмент (С1, С2), транс-компартмент (С5, С6) и промежуточный компартмент
(С3, С4) отличаются спектрами основных реакций.
Слайд 26Созревание белков внутри диктиосомы
Три основных компоненты: сборка цистерны (прямой и обратный транспорт с
ЭПР); синтез углеводов и модификация гликопротеинов; формирование пузырьков (т.н. транс-Гольджи сеть)
Слайд 27Основные функции аппарата Гольджи
Опыты Ньютра и Леблона (1965): интенсивное включение углеводов в АГ
происходит в секретирующих клетках поджелудочной железы.
Посттрасляционная модификация белков; синтез, отщепление, замена и модификация углеводов: гликозилирование, фосфорилирование, сульфатирование.
Формирование сигнальной последовательности молекул.
Формирование предшественников плазматической мембраны.
Слайд 28Гликозилирование белков в аппарате Гольджи
Последовательность основных реакций:
После удаления остатков маннозы в цис-Гольджи
белок переходит в средние цистерны, где удаляются еще две маннозы и добавляются остатки N-ацетилглюкозамина.
В транс-Гольджи добавляется галактоза и N-ацетилнейраминовая кислота.
Все сахара добавляются к олигосахаридам поодиночке. Комплексы сахаров с нуклеотидами импортируются в АГ из цитозоля.
Слайд 29Производные АГ – три типа транспортных пузырьков
Экзоцитозные пузырьки – транспортируются от АГ к
мембране и сливаются с ней, выделяя содержимое во внеклеточную среду и обновляя плазматическую мембрану (конститутивный экзоцитоз).
Секреторные пузырьки – накапливаются в цитоплазме (в виде секреторных гранул); их слияние с плазматической мембраной начинается при появлении в цитоплазме специального сигнала (регулируемый экзоцитоз).
Первичные лизосомы (лизосомные пузырьки) – содержат ферменты лизосом в неактивном виде и сливаются с поздними эндосомами. Содержимое лизосом может выделяться во внешнюю среду только при гибели клетки.
Слайд 30Три основных типа окаймленных пузырьков
Для формирования мембранных пузырьков малого диаметра необходимы специальные белки,
сворачивающие мембрану.
Слайд 31Три основных типа окаймляющих белков
Все белки являются отдаленными «родственниками». Разница состоит в том,
что СОР I встраивается большими кластерами, а СОР II и клатрин – одиночными молекулами. Сворачивание мембраны достигается за счет встраивания части молекулы в наружный липидный монослой. Science, 349:142-143 (2015)
Слайд 32Формирование пузырьков
При формировании мембранных пузырьков сначала образуется «почка», которая потом отшнуровывается с помощью
динамина.