NGS приложения RNA-Seq. Этапы подготовки образца стабилизация РНК презентация

Руководство к действию
По мотивам
Principles of transcriptome analysis and gene expression quantification: an RNA-seq tutorial by Jochen B.W. Wolf

«Мокрая» лаборатория
Сбор образцов
Контаминация
Выделение РНК и оценка качества
Истощение по рРНК
или полиА-обогащение

«Мокрая» лаборатория
Синтез кДНК
Создание библиотеки ДНК
Фрагментация ДНК/получение ампликонов
Лигирование адапторов
Амплификация библиотеки
Нормализация библиотеки

«Мокрая» лаборатория
Стратегия секвенирования
Ion PGM/Ion Proton
Пулирование образцов
Покрытие
Секвенирование
Подготовка матрицы
Секвенирование

Биоинформатика
Вычислительные ресурсы
Навыки программирования
Форматы файлов
Контроль качества

Биоинформатика
Работа с транскриптомом
Variant calling
Количественная оценка экспрессии
Картирование
Определение генов

Статистика
Нормализация
Экспрессия генов
Альтернативный сплайсинг
Функции генов и их взаимодействие

Уровень экспрессии генов
Транскриптом
Таргетные исследования
2. Альтернативный сплайсинг
3. Малые РНК (miRNA, siRNA, snoRNA, snRNA, tRNA, piRNA)
4. Антисмысловые и некодирующие РНК
5. Транскриптом одной клетки
6. Транслируемые РНК (РНК-белковые взаимодействия)
7. Двуцепочечные РНК и вторичные структуры на РНК
Применение NGS для исследования РНК

RNA-seq
Некорректное название изучения РНК с помощью высокопроизводительного секвенирования, т.к. секвенируется не РНК, а кДНК
NGS высокопроизводительное секвенирование. П/ред Д.Ребрикова. М.: Бином, 2014.

RNA-seq
Принцип RNA-Seq заключается в глубоком секвенировании кДНК с добавленными адаптерами на обоих концах кДНК
Wang Z., Gerstein M., Snyder M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics // Nat Rev Genet. - 2009. - Vol. 10, No. 1. - P. 57-63.
Sánchez-Pla A., Reverter F., Ruíz de Villa M.C., Comabella M. Transcriptomics: mRNA and alternative splicing// J Neuroimmunol. - 2012. - Vol. 248, No. 1-2. - P. 23-31.

Wang Z., Gerstein M., Snyder M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics // Nat Rev Genet. - 2009. - Vol. 10, No. 1. - P. 57-63.
Схема типичного эксперимента RNA-seq

NGS
http://gcat.davidson.edu/phast/

RNA-Seq для анализа РНК
Шаг 1: Стабилизация РНК образце
Шаг 2: Выделение РНК из образца
Шаг 3: Приготовление библиотеки
Шаг 4: Секвенирование
Шаг 5: Анализ данных
Life Technologies—Sample to RNA-Seq. 2012

Шаг 1: Стабилизация РНК

Инактивирует РНКазы
Стабилизирует РНК
Исключается необходимость замораживания и измельчения образцов
Совместим с наборами реагентов для выделения РНК
Гибкие условия хранения тканей:
РНК стабильна 1 день при +37°C,
1 неделю при +25°C,
1 месяц при +4°C
и в течение долгого периода при -20°C
RNAlater® Tissue Collection: RNA Stabilization Solution
Реагент для стабилизации и защиты клеточной РНК
Форматы: AM7020 - 100 мл
AM7021 - 500 мл
AM7024 - 250 мл

Шаг 2: Выделение РНК

Основные наборы для выделения РНК
Наборы для выделения РНК из широкого ряда образцов
*Количество исходного материала
Кат.ном.: 12183018A - PureLink® RNA Mini Kit
AM1560 - mirVana™ miRNA Isolation Kit
610-21 - Dynabeads® mRNA DIRECT™ Micro Kit

Набор для выделения мРНК
Dynabeads® mRNA DIRECT™ Micro Kit
Dynabeads® Oligo (dT)25 – суперпарамагнитные частицы с олиго(dT)-последовательностью, ковалентно прикрепленной на поверхности
Метод валидирован для создания транскриптомных библиотек для RNA-Seq при помощи Ion Total RNA-Seq Kit v2
Суперпарамагнетизм — форма магнетизма, проявляющаяся у ферромагнитных и ферримагнитных частиц.
В обычном состоянии не проявляют магнитные свойства, но при воздействии магнитного поля они становятся намагниченными

Специализированные наборы для выделения РНК
Наборы для выделения РНК оптимизированные
Парафинизированные образцы
MagMAX™ FFPE Total Nucleic Acid Isolation Kit
RecoverAll™ Total Nucleic Acid Isolation Kit
for FFPE
Кровь
MagMAX™ for Stabilized Blood Tubes RNA Isolation Kit
Вирусы
PureLink® Viral RNA/DNA Mini Kit

Прокариоты:
80% рРНК
15% тРНК
4-5% мРНК и некодРНК
Эукариоты:
Человек 1-5% мРНК

Обогащение РНК
Набор RiboMinus™ Eukaryote Kit v2 для удаления рРНК
Мишени:
28S, 18S, 5.8S, 5S субъединицы цитоплазматической рРНК
12S и 16S субъединицы митохондриальной рРНК
• 1 час
• магнитные частицы
• 1-5 мкг или 100 нг – 1 мкг
Данные NGS для универсальной референсной РНК человека до и после удаления рРНК

Обогащение РНК
Набор RiboMinus™ Eukaryote Kit v2 для удаления рРНК
Взаимодействие биотинилированного зонда с рРНК
Удаление рибосомальной РНК за счет взаимодействия биотин-стрептавидин
магнитная
частица со
стрептавидином
биотинилированный
олигонуклеотид-приманка
рРНК
мРНК

RiboMinus™ для гибридизации с высококонсервативными участками
5S, 5.8S, 18S и 28S рРНК,
состоит из смеси олигонуклеотидов (содержащих по 3 LNA™ мономера*), включающей по 2 специфичных зонда к каждому классу рРНК.
*LNA (locked nucleic acid) - «закрытая» нуклеиновая кислота
Зонды RiboMinus™ для гибридизации с рРНК

«Закрытая» нуклеиновая кислота — класс бициклических аналогов ДНК/РНК, у которых рибозное кольцо находится в C3’-эндо конформации, благодаря появлению 2’-O,4’-C метиленового мостика; в результате этого происходит «закрывание» рибозы.
Модифицированные таким образом нуклеотиды демонстрируют высокие термостабильность и сродство в дуплексе с целевыми молекулами РНК.
LNA мономеры в зондах RiboMinus™

1.
2.
3.
4.
10 мин 70⁰C – денатурация
20 мин 37⁰C – гибридизация с биотинилированными зондами
5 мин 37⁰C – гибридизация с частицами со стрептавидином
30 мин – концентрирование РНК на магнитных частицах Nucleic Acid Binding Beads
Отбор супернатанта из образца в магнитном поле (без рРНК)
Рабочий процесс
RiboMinus™ Eukaryote System v2 Workflow
Кат.ном.:
A15020 - RiboMinus™ Eukaryote Kit v2
A15026 - RiboMinus™ Eukaryote System v2

Контроль
The External RNA Controls Consortium (ERCC)
Консорциум по контрольной внешней РНК (ERCC) - спецгруппа из академических, частных и общественных организаций.
ERCC - набор контрольной РНК для оценки качества экспрессии генов на различных платформах:
количественная ОТ-ПЦР,
микрочипы,
NGS технологии.

Контроль
ERCC RNA Spike-In Control Mixes
Кат.ном.:
4456739 - ERCC RNA Spike-In Control Mixes
92 варианта полиаденилированных транскриптов
Размер транскриптов 250-2000 нукл.
«мимикрирует» под естественную эукариотическую мРНК
Используется для оценки точности измерений дифференциальной экспрессии генов
Состав:
• 10 мкл ExFold Spike-In Mix 1
• 10 мкл ExFold Spike-In Mix 2
• 1.75мл вода без нуклеаз
Transcript molar ratios in ERCC RNA Spike-In Control Mixes. The transcripts in Spike-In mix 1 and Spike-In mix 2 are present at defined mix 1:mix 2 molar concentration ratios, described by 4 subgroups. Each subgroup contains 23 transcripts spanning a 106-fold concentration range, with approximately the same transcript size distribution and GC content. The controls are ideal for next-generation sequencing experiments.

Шаг 3: Приготовление библиотеки

Набор Ion Total RNA-Seq Kit V2.0
Библиотека за 6 часов
Единый набор для получения ориентированной библиотеки кДНК для любых видов РНК
Рекомендации:
1–500 нг поли(А) РНК,
10–500 нг тотальной РНК без рРНК
Тотальная РНК высокого качества (RIN >7)
Ion Total RNA-Seq Kit v2 Publication Number 4476286 Revision E © 2013 Life Technologies Corporation
Может использоваться для анализа как коротких РНК, так и полного набора транскриптов в клетке (транскриптома).

Ligase-Enhanced Genome Detection (LEGenD)
Двуцепочечные гетеродуплексные РНК/ДНК-адаптеры специфично присоединятся к 3’- и 5’-концам РНК за одну реакцию лигирования
В реакцию вступает одна цепь адаптера, причем только с одним из концов молекулы
Направленное и одновременное присоединение адаптеров РНК-лигазой. LEGenD™ Ligase Mix – высокоэффективный фермент, специфически распознающий двуцепочечные молекулы.
кДНК синтезируется с отдельного праймера, комплиментарного 3’-адаптеру

OH
P
P
OH
NNNNNN
3’ DNA
adaptor
3’ ‘guide’ adaptor (3’ blocked)
12,14,16 nts
Единый набор для получения ориентированной библиотеки кДНК для любых видов РНК

Oligonucleotides and methods
for the preparation of RNA libraries
Oligonucleotides and methods for the preparation of rna libraries US 20140128291 A1

Ion Total RNA-Seq Kit v2: Рабочий процесс
Магнитные частицы
Магнитные частицы
Магнитные частицы
< 6 часов
< 5 часов
Магнитные частицы
Магнитные частицы
Магнитные частицы

Секвенирование малых РНК
Малые РНК – короткие некодирующие молекулы РНК
tRNA - транспортировка аминокислот к месту синтеза белка.
snRNA - класс РНК, которые встречаются в ядре эукариотических клеток. Они транскрибируются РНК-полимеразой II или РНК-полимеразой III и участвуют в важных процессах, таких как сплайсинг (удаление интронов из незрелой мРНК), регуляции факторов транскрипции (7SK РНК) или РНК-полимеразы (B2 РНК) и поддержании целостности теломер.
snoRNA - малые ядрышковые РНК считаются подгруппой малых ядерных РНК. Участвуют в химических модификациях (метилировании и псевдоуридилировании) рибосомных РНК, а также тРНК и малых ядерных РНК.
miRNA - малые некодирующие молекулы РНК длиной обнаруженные у растений, животных и некоторых вирусов, принимающие участие в транскрипционной и посттранскипционной регуляции экспрессии генов путем РНК-интерференции.
siRNA - малые интерферирующие РНК или короткие интерферирующие РНК, класс двухцепочечных РНК, Принимают участие в процессах РНК-интерференции, понижая экспрессию специфических генов.
piRNA - наиболее крупный класс малых некодирующих РНК, экспрессируемых в клетках животных; они обнаружены в комплексах с белками семейства Piwi, за что и получили своё название. piРНК обычно длиннее микроРНК и малых интерферирующих РНК и имеют , кроме того, в отличие от микроРНК, они не так консервативны.
от 73 до 93
нуклеотидов
18-25 нуклеотидов
(в среднем 22)
20-25 нуклеотидов
26—32 нуклеотида

Создание библиотеки малых РНК
Гибридизация и лигирование адаптеров с РНК
• Ion Adaptor Mix v2
• Hybridization Solution
• 2X Ligation Buffer
• Ligation Enzyme Mix
• 3 µL of small RNA sample
(1–100 ng of miRNA in ≤1 µg of enriched small RNA)
Обратная транскрипция
• Nuclease-Free Water
• 10X RT Buffer
• 2.5 mM dNTP Mix
• Ion RT Primer v2
• 10X SuperScript® III Enzyme Mix

Фермент для обратной транскрипции
SuperScript III
(50°С оптимум температуры)
Чем выше термостабильность ревертазы,
тем выше эффективность обратной транскрипции
(связано с денатурацией вторичных структур РНК при повышении температуры)
+ сниженная RNase H активность
(SuperScript® III RT was engineered to contain mutations that knock out the RNase H activity)

Создание библиотеки малых РНК
Очистка и size-select кДНК на магнитных частицах
1) Первое связывание: на частицах задерживаются большие молекулы кДНК (tRNA и rRNA).
2) Второе связывание: целевые продукты кДНК (miRNA и другие маляе РНК) при повышении концентрации EtOH из надосадочной жидкости повторно связываются с частицами.
3) Элюция целевых продуктов кДНК водой Nuclease-Free (37°C).
• Wash Solution Concentrate
• Binding Solution Concentrate
• Nucleic Acid Binding Beads
• Processing Plate
• Nuclease-Free Water
Кат.ном.: AM10027 - Magnetic stand for 96-well plates (Ambion®)
AM10050 - Magnetic stand for 96-well plates (Ambion®)

Создание библиотеки малых РНК
Амплификация кДНК
Компоненты Ion Total RNA-Seq Kit v2 для библиотек без баркода:
• Ion 5′ PCR Primer v2
• Ion 3′ PCR Primer v2
• Platinum® PCR SuperMix High Fidelity
Компоненты Ion Xpress™ RNA-Seq Barcode 1–16 Kit для баркодированных библиотек:
• Ion Xpress™ RNA-Seq Barcode BC 01 – BC 16
• Ion Xpress™ RNA 3′ Barcode Primer
Platinum® PCR SuperMix High Fidelity – высокоточная полимераза
Кат.ном.: 4475485 - Ion Xpress™ RNA-Seq Barcode 1-16 Kit

Создание библиотеки малых РНК
Очистка и size-select амплифицированной ДНК на магнитных частицах
1) Первое связывание: на частицах задерживаются большие молекулы кДНК (tRNA и rRNA).
2) Второе связывание: целевые продукты кДНК (miRNA и другие малые РНК) при повышении концентрации EtOH из надосадочной жидкости повторно связываются с частицами.
3) Элюция целевых продуктов кДНК водой Nuclease-Free (37°C).
• Wash Solution Concentrate
• Binding Solution Concentrate
• Nucleic Acid Binding Beads
• Processing Plate
• Nuclease-Free Water
Кат.ном.: AM10027 - Magnetic stand for 96-well plates (Ambion®)
AM10050 - Magnetic stand for 96-well plates (Ambion®)

Создание библиотеки малых РНК
Оценка выхода и размеров амплифицированной ДНК
Agilent® 2100 Bioanalyzer® instrument with the Small RNA Kit chip
Задать размерные границы продуктов ПЦР:
50–300 bp (все продукты после лигирования)
86–106 bp (для небаркод. библиотек) или
94–114 bp (для баркодированных библиотек)
b. Сколько микроРНК в реакции?
c. Концентрация кДНК?

Создание библиотеки малых РНК
b. Сколько микроРНК
в реакции?
Библиотека без баркода:
[Area (86–106 bp)] ÷ [Area (50–300 bp)]
Баркодированная библиотека:
[Area (94–114 bp)] ÷ [Area (50–300 bp)]
Пример:
% miRNA library = (30.3 ÷ 44.5) × 100 = 68%

Создание библиотеки малых РНК
b. Сколько микроРНК
в реакции?
≥50% Всё ОК, идем дальше.
<50% Всё почти ОК,
будет картироваться большее количество нецелевых ридов (без вставки, тРНК, рРНК) по сравнению с уровнем ≥50%.

Создание библиотеки малых РНК
Разведение библиотек
• Ion PI™ Template OT2 200 kit (обновления!)
Конечная концентрация: 11 pM.
Пример:
– The library concentration is 2200 pM.
– The library dilution is 2200 pM/11 pM = 200.
– Therefore, 1 µL of library mixed with 199 µL of Low TE (1:200 dilution) yields approximately 11 pM.
• Ion OneTouch™ 200 Template v2 DL
Конечная концентрация: 14 pM.
Пример:
– The library concentration is 2200 pM.
– The library dilution is 2200 pM/14 pM = 157.1
– Therefore, 1 µL of library mixed with 156.1 µL of Low TE (1:157.1 dilution) yields approximately 14 pM.

Шаг 4: Секвенирование

Выбор стратегии обогащения зависит от вопроса, на который вы ищете ответ

Select number of reads & enrichment to fit the level of sequencing you need to answer your question

Схемы обогащения при дизайне исследования RNA-Seq

Технология Ion AmpliSeq™ RNA
1. Обратная транскрипция
2. Ген-специфическая ПЦР
3. Лигирование ION-адаптеров
Ion AmpliSeq™ RNA similarly creates a library of gene specific assays (up to 300 in a pool) that can be used to measure the abundance of multiple genes at one time by counting fragments using an Ion Torrent sequencer
Доступно 96 баркодов

One assay per gene (assay = gene specific PCR amplicon)
Assay crosses exon-exon boundary
Designed to detect the maximum number of transcripts assigned to each gene
Дизайн Ion AmpliSeq™ RNA

Обратная транскрипция (~30 мин)
Амплификация выбранных участков при помощи готовых/пользовательских панелей (~90 мин)
Лигирование адаптеров (~40 мин)
Очистка на магнитных частицах (~35 мин)
Амплификация библиотеки (~10 мин)
1 round cleanup
2nd PCR
2 round cleanup
Library quantitation
Quantitation kit (~45-60 мин)
или BioAnalyzer (~35 мин)
Обрезание праймеров и фосфорилирование (~40 мин)
Очистка на магнитных частицах (~20 мин)
Всего ~5 ½ часов
Рабочий процесс Ion AmpliSeq™ RNA

Fusion transcript
Ion AmpliSeq™ RNA Fusion Transcript Detection
S. Magdaleno et al. Using Ion AmpliSeq™ RNA to Detect Fusion Transcripts in Human Cancer Samples. © 2013 Life Technologies

Ion AmpliSeq™ RNA design strategy for
detection of fusion transcripts
WT RNAseq
Only a fraction of the reads cross through the fusion breakpoint

Ion AmpliSeq™ RNA design strategy for
detection of fusion transcripts
Ion AmpliSeq™ RNA strategy for fusion transcripts
Focus reads around breakpoint
Use optimized design strategy for all fusion transcripts into single custom panel

Ion AmpliSeq™ RNA design strategy for
detection of fusion transcripts
Ion AmpliSeq™ RNA
All reads map to designed breakpoint between fusion gene partners if it is present in sample.
Allows focused concentration of reads on areas of interest for enhanced sensitivity of detection of the fusion transcript.

RNA Cancer Panel
50 генов
Соответствует генам панели AmpliSeq Cancer Hotspot v2
RNA Stem Cell Panel
243 генов
Факторы дифференцировки и плюрипотентности
RNA Apoptosis Panel
267 генов
Валидированные тест-системами TaqMan®
RNA Custom Panels
До 300 генов на ваш выбор
Дизайн с 1 пулом
Новые панели для анализа экспрессии:
AmpliSeq™ RNA Panels

Can multiplex up to 10 libraries on a single 318 chip and maintain expected gene expression profiles
Ion AmpliSeq™ RNA Cancer Panel
High correlation between tumor/normal GEx fold change
Ion AmpliSeq™ RNA Apoptosis Panel
High AmpliSeq™ RNA Correlation to TaqMan®

Ion AmpliSeq™ Transcriptome Human Gene Expression Research Panel
Панель рассчитана на выявление
18 574 кодирующих генов и
2 228 некодирующих генов
на основании аннотации генома человека UCSC hg19
20 802 ампликона (41 604 праймера)
средний размер рида 150 п.о.
1 пробирка.
Кат.ном.:
A26325 Ion AmpliSeq™ Transcriptome Human Gene Expression Kit* 24 rxns
A26326 Ion AmpliSeq™ Transcriptome Human Gene Expression Kit* 96 rxns
A26327 Ion AmpliSeq™ Transcriptome Human Gene Expression Kit* 384 rxns
4471250 Ion Xpress™ Barcode Adapters 1-16 Kit 1 kit

Ion AmpliSeq™ Transcriptome Human Gene Expression Research Panel
Рекомендация: секвенируйте 8 образцов на чипе Proton PI™ Chip.
Измерение кратного изменения экспрессии гена в образцах
Требует 10 нг FFPE общей РНК (истощение по рРНК или полиА+ обогащение не требуется)
Создание библиотек при помощи Ion AmpliSeq™ Kit Plus и баркодированных адаптеров Ion Xpress™ Barcode Adapters
Совместим с системами пробоподготовки Ion Chef ™ и Ion OneTouch™ Systems и секвенаторами Ion Proton™ и Ion PGM™

Ion AmpliSeq™ Transcriptome
Improved gene-level transcript
detection using the Ion AmpliSeq™
Transcriptome Human Gene Expression Kit
and the Ion Proton™ System. A Venn diagram
demonstrating the concordance of genes
identifi ed by MAQC microarray data and the
Ion AmpliSeq™ Transcriptome Human Gene
Expression Kit.

Ion AmpliSeq™ Transcriptome
Detection of significantly differentially
expressed genes (DEGs) by using the
Ion AmpliSeq™ Transcriptome Human Gene
Expression Kit. The Venn diagram shows the
concordance of significant DEGs between MAQC
microarray and Ion AmpliSeq™ Transcriptome
Human Gene Expression Kit data.

Шаг 5: Анализ данных

1. Малые РНК (miRNA, snoRNA, piRNA, snRNA, tRNA и др.)

2. Уровень экспрессии генов

3. Альтернативный сплайсинг

4. Транскриптом одной клетки

5. Антисмысловые и некодирующие РНК

6. Транслируемые РНК