Биотехнология. Вектора. Метод Максама—Гилберта презентация

Вектор pUC18
Размер — 2686 п.о.
ampr – ген bla (β-лактамаза)

Делеция Rop
и мутация в RNA II увеличивают копийность
pBR322 (pMB1) 15-20
pUC 500-700
Репликация
pMB1/colE1
Участок ori

β-галактозидаза
1,024 ак
Бета-галактозидаза — фермент, обладающий способностью катализировать расщепление лактозы до глюкозы и галактозы

От гена к белку

Считываемая цепь ДНК называется матричной или некодирующей.
Противоположная цепь называется кодирующей
РНК считывается с одной цепи ДНК
Для каждого гена одна из цепей ДНК кодирующая.
Разные гены могут считываться с противоположных цепей ДНК

Синтез РНК
РНК-полимеразой
5’-3’ направление синтеза
затравка не нужна
РНК-полимераза сама расплетает ДНК
Синтез РНК происходит процессивно
Во время синтеза только часть молекулы РНК спарена с матрицей

Белок-репрессор
транскрипции

Белок-активатор
транскрипции

Гены
lac-оперона
lacZ кодирует фермент β-галактозидазу, которая расщепляет дисахарид лактозу на глюкозу и галактозу
lacY кодирует β-галактозид пермеазу, мембранный транспортный белок, который переносит лактозу внутрь клетки
lacA кодирует β-галактозид трансацетилазу, фермент, переносящий ацетильную группу от ацетил-КoA на бета-галактозиды
Для катаболизма лактозы необходимы только продукты генов lacZ и lacY, роль продукта гена lacA не ясна.

Регуляция lac-оперона
схема Жакоба-Моно

Регуляция lac-оперона

Регуляция lac-оперона

cAMP

Lac-оперон
фф

β-галактозидаза
1,024 ак
Бета-галактозидаза — фермент, обладающий способностью катализировать расщепление лактозы до глюкозы и галактозы

Альфа комплементация
Альфа-комплементация (аlpha-complementation or α-complementation) —
способность короткого (1–92 аминокислотные остатки) N-концевого фрагмента β-галактозидазы взаимодействовать с ее С- концевым фрагментом,
образуя функциональный фермент

Субстрат Xgal (5-бром-4-хлор-3-индолил-бета-D-галактопиранозид)

Зачем нужен ИПТГ?
Активация lac промотора
Связывается с lac-репрессором

Трансформация pUC19 специальных штаммов E.coli
Колонии
Альфа комплементация
Чашки Ap+Xgal+IPTG

Трансформация

Электропорация

R-M системы
Kommireddy Vasu, and Valakunja Nagaraja Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2013;77:53-72

Варианты R-M систем

Рестриктазы

Рестриктаза EcoRI
5´ ... G^A A T T C ... 3´
3´ ... C T T A A^G ... 5´
5´ ... G^ 3’ 5’ A A T T C ... 3´
3´ ... C T T A A 5’ 3’ ^G ... 5´
EcoRI
EcoRI

X. Смит и Д. Натане в 1973 г. предложили номенклатуру рестриктаз Genus+SPecies (strain)
EcoRI – Escherichia coli strain R, 1st enzyme
BamHI – Bacillus amyloliquefaciens strain H, 1st enzyme
DpnI – Diplococcus pneumoniae, 1st enzyme
HindIII – Haemophilus influenzae, strain D, 3rd enzyme
BglII – Bacillus globigii, 2nd enzyme
PstI – Providencia stuartii 164, 1st enzyme
Sau3AI – Staphylococcus aureus strain 3A, 1st enzyme
KpnI – Klebsiella pneumoniae, 1st enzyme

Липкие концы
5’-концевая избыточность
Липкие концы
3’-концевая избыточность

Липкие концы
5’-концевая избыточность
Тупые концы

4:
AluI 5´ ... AG^CT ... 3´ тупые
MspI 5´ ... C^CGG ... 3´ 5’ концевая избыточность (2 bp)
6
PvuII 5´ ... CAG^CTG ... 3´ тупые
KpnI 5´ ... GGTAC^C ... 3´ 3’ концевая избыточность (4 bp)
8
NotI 5´ ... GC^GGCCGC ... 3´ 5’ концевая избыточность (4 bp)
Необычные сайты
MwoI 5´ ... GCNNNNN^NNGC ... 3´ 3’ концевая избыточность
3´ ... CGNN^NNNNNCG ... 5´ (3 bp)
Рестриктазы

Изошизомеры:
рестриктазы, узнающие одинаковую
последовательность
Asp 718 5’ g gtacc 3’
Kpn I 5’ ggtac c 3’

Картирование 1

Картирование 2

Картирование 3

T4 DNA лигаза
3’-OH
5’-P
Разрыв цепи ДНК

3’-OH
5’-P

T4 DNA
лигаза
3’-OH
5’-P

+
ДНК-лигаза

Бело-голубая селекция клонов

Соединение фрагментов с совместимыми липкими концами
G gatcC
A gatcT

Щелочная фосфотаза
Увеличение выхода рекомбинантных молекул

Клонирование по двум рестриктазам

PCR

ТА-клонирование

Нематричный синтез ДНК
ДНК-полимеразами

Приготовление вектора
Nucleic Acids Research, Vol. 19, No. 5
A simple and efficient method for direct cloning of PCR products using ddT-tailed vectors
T.A.Holton* and M.W.Graham
Терминальная трансфераза
осуществляет нематричный синтез
полинуклеотидной цели ДНК
и способна включать
произвольное количество
нуклеотидов на 3 -конце

Приготовление вектора
Рестриктаза,
дающая тупые концы +
+ Taq, dTTP

Приготовление вектора
Специальные векторы на основе pUC:

Безлигазное клонирование

Безлигазное ТА-клонирование

Безлигазное клонирование
ТА-клонирование

Вектор для ТА-клонирования

Бактериофаг М13

F-плазмида

Бактериофаг М13

M13 mp вектор

4-
Вектор pBluescript

Методы определения последовательности нуклеотидов
Метод Максама—Гилберта
Метод Сэнгера
1977 год

Электрофорез

Метод Максама—Гилберта
В основе метода секвенирования ДНК
путем химической деградации лежит
ограниченное расщепление меченого
фрагмента ДНК под действием
специфических реагентов.
Непременным условием проведения
секвенирования этим методом
является наличие фрагмента ДНК,
меченного только по одному концу.

Метод Сэнгера

Метод Сэнгера

Метод Сэнгера
AGCT

Для разделения фрагментов ДНК с разрешением
в 1 нуклеотид используют:
8–10% полиакриламидный гель
7М мочевина
Температура в геле
при проведении
электрофореза 60–80 С

Электрофорез
Хорошее разрешение
фрагментов
41/40=1,025
Плохое разрешение
фрагментов
401/400=1,0025
Короткие фрагменты
«пробегают» большое
расстояние в геле,
длинные — маленькое

Автоматическое секвенирование ДНК

Пример определения последовательности

Пример определения последовательности —
малые длины

Определение последовательности длинных фрагментов (Shotgun sequencing)
Случайное разрезание (Shotgun)
Фрагмент генома
Прочтение каждого клонированного фрагмента с обоих концов
~500 bp
~500 bp
Клонирование фрагментов

Реконструирование последовательности
(Fragment Assembly)
Необходимо 7–10 кратное прочтение каждого участка
reads

Редактирование генома

Восстановление двунитевых разрывов ДНК
homology-directed
repair (HDR)
рекомбинационная репарация
non-homologous
end-joining (NHEJ)
error-prone
негомологичное
соединение концов

4L = 109 (размер генома человека)
log4L = log109
2L log2 = 9
L = 15

CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) — это кластеризованные регуляторные разделенные промежутками короткие палиндромные повторы или участки ДНК, содержащие множественные повторы, разделенные уникальными участками — спейсерами
Хромосома бактерии
Cavanagh & Garrity, “CRISPR Mechanism”, CRISPR/Cas9, Tufts University, 2014.
https://sites.tufts.edu/crispr/ (Date of Access)

РНК-направляемые нуклеазы CRISPR/Cas система
CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) — это кластеризованные регуляторные разделенные промежутками короткие палиндромные повторы или участки ДНК, содержащие множественные повторы, разделенные уникальными участками — спейсерами

Иммунная система бактерий

Иммунная система бактерий

Иммунная система бактерий

Class 2,
Type II CRISPR-Cas9 System
from Streptococcus thermophilus
Механизм действия
CRISPR/Cas9 в клетках
бактерий

Единая химерная sgRNA для внесения двухцепочечных разрывов в целевых локусах. Комплекс sgRNA и Cas9 способен вносить двухцепочечные разрывы в выбранных сайтах ДНК. SgRNA – искусственно созданная конструкция, представляющая собой объединенные в одну молекулу РНК элементы системы CRISPR/Cas9: crRNA и tracrRNA. Протоспейсер – сайт, который узнает система CRISPR/Cas9. Спейсер – последовательность в составе sgRNA, которая отвечает за связывание целевого сайта по принципу комплементарного взаимодействия. RuvC и HNH – каталитические
домены, которые вносят разрывы в цепи ДНК в целевом сайте. PAM – короткий мотив (NGG в случае CRISPR/Cas9), наличие которого с 3'-конца протоспейсера обязательно для внесения разрыва

Создание RGEN
(RNA-guided engineered nuclease)

Создание RGEN
(RNA-guided engineered nuclease)

hCas9 – последовательность белка Cas9, оптимизированная для экспрессии в клетках эукариот. sgRNA – единая химерная РНК, содержащая части crRNA и tracrRNA, необходимые для функционирования. NLS – сигнал ядерной локализации, который обеспечивает попадание конструкций в ядро.
Поли(А) – сигнал полиаденилирования
Схема генетической конструкции,
экспрессирующей элементы системы CRISPR/Cas

TALEN
(Transcription Activator-Like Effector Nucleases;
эффекторные нуклеазы, подобные активаторам
транскрипции)

Transcription Activator-Like Effectors,
TALE
TALE белки были обнаружены у бактерий рода Xanthomonas поражающих рис, перец, хлопок и другие растения.
Бактерии секретируют в цитоплазму растительных клеток эффекторные белки (TALE), которые влияют на процессы в растительной клетке и увеличивают ее восприимчивость к патогену.
Эффекторные белки способны связываться с ДНК и активировать экспрессию своих генов-мишеней, имитируя факторы транскрипции эукариот.

TALE состоят из центрального домена,
ответственного за связывание ДНК, сигнала ядерной локализации (NLS) и домена, активирующего транскрипцию целевого гена (AD)
repeat-variable diresidue (RVD)

TALEN
(Transcription Activator-Like Effector Nucleases)
Sanjana, N. E., Cong, L., Zhou, Y., Cunniff, M. M., Feng, G., & Zhang, F. (2012).
A Transcription Activator-Like Effector (TALE) Toolbox for Genome Engineering.
Nature Protocols, 7(1), 171–192. http://doi.org/10.1038/nprot.2011.431

Транскрипционные факторы
Транскрипционные факторы содержат следующие домены:
ДНК-связывающий домен (DBD) — взаимодействует со специфичными последовательностями ДНК, характерными для промоторов и энхансеров. Специфичность распознавания определенных последовательностей определяет набор генов, подверженных регуляции данным ТФ;
трансактивирующий домен (TAD) — содержит участки связывания других белков, например, транскрипционных корегуляторов ;
сигналраспознающий домен (SSD) (например, лиганд-связывающий домен), который чувствителен к внешнем сигналам и отвечающим за передачу сигнала к другим компонентам транскрипционного комплекса, что вызывает повышение или понижение уровня экспрессии

Большая и малая бороздки ДНК

Как узнать последовательность нуклеотидов
не расплетая ДНК

Как узнать последователь-ность
нуклеотидов
не расплетая ДНК

Как узнать последовательность нуклеотидов ДНК

Спираль-поворот-спираль

Спираль-поворот-спираль
N-конец
С-конец

Спираль-поворот-спираль

Lac-репрессор

Гомеодомен
Домен состоит из 60 остатков аминокислот, образует структуру спираль-поворот-спираль,
в которой альфа-спирали связаны короткими петлевыми участками.
Две спирали на N-конце являются антипараллельными, и длиннее спирали на C-конце,
которая перпендикулярна осям N-концевым петлям.
Непосредственно С-концевая спираль взаимодействует с ДНК.
Широко распространен
среди факторов
транскрипции
эукариот

Спираль-петля-спираль

Лейциновая застёжка-молния
(leucine zipper)
Leucines

Цинковый палец
(zinc finger domain)

Цинковый палец
(zinc finger domain)

Цинковый палец

Цинковый палец

Создание ZFN
(zinc-finger nuclease)

Каждый
палец
узнает
3 нуклеотида
Всего нужно 64 пальца