Эволюционная иммунология. Защитные системы прокариот презентация

Зачем вообще изучать защитные системы микробов?
«We observed a significant decrease in the ability of the cas9 mutant to adhere to, invade and replicate in human epithelial cells, leading to an overall defect in survival, indicating that Cas9 plays an important role in N. meningitidis pathogenesis. Additionally, a recent study identified Campylobacter jejuni Cas9 as critical for interactions with host cells23. Bioinformatic analysis predicted that N. meningitidis, C. Jejuni and other pathogens may encode a scaRNA, which is critical for Cas9 targeting of endogenous mRNA. Together, these results clearly show that Cas9 controls virulence traits of several bacteria.»

Фаги регулируют микробиоту кишечника

Фаги как маркер (или причина) дисбиоза

Система CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) – Cas (Cass)

Система CRISPR-Cas защищает бактерий от бактериофагов
1. ДНК бактериофага нарезается специальными Cas-белками бак-терии на маленькие фрагменты. Они добавляются в определен-ный участок генома бактерии, который называется CRISPR. Если бактерия не погибает, то она таким образом «запоминает» часть генома вируса.
2. Со всего, что находится в CRISPR, синтезируются специальные РНК, постоянно проверяющие, не комплементарны ли они какой-нибудь ДНК, попавшей в бактерию.
3. Если совпадение найдено, значит в бактерию попала ДНК такого же вируса, как и раньше. Его «вспоминают» и уничтожают другие Cas-белки.

Характеристики системы CRISPR
Присуща практически всем археям и половине бактерий
CRISPR-кассета состоит из одинаковых повторов и различающихся спейсеров, причём повторы не являются консервативными, однако часто начинаются на 5`-GTTTC и заканчиваются на GAAAC-3`
По соседству с CRISPR-кассетой находится оперон cas-генов
Среди продуктов cas-генов выделяются 6 основных и множество вспомогательных белков (RAMP)
В одном геноме может быть до 18 CRISPR-кассет
В одной CRISPR-кассете может быть до 375 спейсеров
Повторы варьируют в размере в диапазоне 23 – 47 п.н., спейсеры – 21 – 72 п.н.

Предполагалось, что CRISPR-Cas действует по схожему с РНК-интерференцией механизму…
… и она действительно может быть направлена против РНК, однако основной ее мишенью является двунитевая ДНК

Принципиальная структура CRISPR

Открытие CRISPR
Yoshizumi Ishino
Ishino, Y., et al. (1987). Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli, and identification of the gene product. J. Bacteriol. 169, 5429–5433.
Francisco Mojica
Mojica, F.J.M et al. (1993). Transcription at
different salinities of Haloferax mediterranei sequences adjacent to partially modified PstI sites. Mol. Microbiol. 9, 613–621.

Принцип сполиготипирования

История открытия функции CRISPR
Родольф Баррангу
Филипп Хорват
DANISCO

Разнообразие спейсеров и приобретение новых
РАМ – нуклеотидный мотив, который позволяет исполь-зовать часть чужеродной ДНК в качестве пригодной для создания нового спейсера

Примеры некоторых proto-spacer adjacent motifs (РАМ)

Cas-белки и их функции

Классификация систем на основе CRISPR
Евгений Кунин Кира Макарова

Классификация вариантов CISPR-Cas

Новая классификация CISPR-Cas (2015 г.)

Cascade Csm

Процессинг РНК в системе CRISPR I типа

Процессинг РНК в системе CRISPR II типа

Система II типа
Система I типа

Почему нет атаки на саму CRISPR-кассету?
Критическим является строгое Уотсон-Криковское связывание -2 – -4 нуклеотида к 5`-концу от спейсера. Если оно есть, значит «ДНК-мишень» - своя, и расщеплять её нельзя

Атака ДНК-мишени возможна и в случае неполного соответствия спейсера и протоспейсера.
Критическим является связывание 5`-конца спейсера

Распространенность CRISPR-Cas

Эволюция систем CRISPR-Cas

Применение Cas9 для редактирования генома
Feng Zhang
Jennifer Doudna
Emmanuelle Charpentier

Редактирование геномов эукариот при помощи CRISPR-Cas9

Химерная РНК, совмещающая элементы crРНК и tracrРНК
Martin Jinek

Белок Cas9 и химерная tracr-crРНК способны эффективно редактировать любые геномы

CRISPR – история открытия (резюме)

Где уже применили Cas9?
2017
2012
2013
2014
2015
2016
2011
Cas9
1529
2185
739
329
85
3
3
1997
2002
2003
1
1
1

«Ножницы для генома» не гарантируют его адекватное сшивание после разрезания

Трансгенные мыши, получаемые с использованием Cas9
Masahito Ikawa

MCR – mutagenic chain reaction

Этическая сторона вопроса

Cpf1 – альтернатива Cas9

Анти-CRISPR системы

Механизмы работ анти-CRISPR систем

CRISPR-Cas может быть направлена и против фагов с РНК-геномом (VI тип)
Leptotrichia shahii

Успешная кооперация защитных систем

Отсутствие кооперации защитных систем

Судьба древних прокариотических защитных систем и происхождение эукариот