Слайд 2
![Технологические варианты секвенирования Методы секвенирования I поколения (по Сэнгеру, по](/_ipx/f_webp&q_80&fit_contain&s_1440x1080/imagesDir/jpg/232827/slide-1.jpg)
Технологические варианты секвенирования
Методы секвенирования I поколения (по Сэнгеру, по Максаму –
Гилберту, автоматическое секвенирование по Сэнгеру)
Методы секвенирования II поколения
– пиросеквенирование
– секвенирование с лигированием
– полупроводниковое секвенирование
– методы синтеза с обратимым терминированием
Методы секвенирования III поколения
– секвенирование с помощью нанопоры
– полногеномное секвенирование единичной молекулы
Слайд 3
![Методические варианты секвенирования 1. Секвенирование ДНК (геном) / Секвенирование РНК=>кДНК](/_ipx/f_webp&q_80&fit_contain&s_1440x1080/imagesDir/jpg/232827/slide-2.jpg)
Методические варианты секвенирования
1. Секвенирование ДНК (геном) / Секвенирование РНК=>кДНК (транскриптом)
2. Ресеквенирование
/ Секвенирование de novo
3. Целевое секвенирование (target sequencing) (напр., экзом, 16S рРНК, позиционные методы) / Полногеномное секвенирование (Whole Genome Sequencing, WGS)
4. Секвенирование в пределах одного вида / Метагеномное секвенирование
5. Секвенирование ДНК совокупности клеток / Секвенирование ДНК одиночных клеток (single-cell sequence)
6. Определение первичной структуры / Определение 3D структуры
7. Качественные методы / Количественные методы
Слайд 4
![Этапы секвенирования 1. Выделение ДНК. 2. Создание геномной библиотеки (полногеномное](/_ipx/f_webp&q_80&fit_contain&s_1440x1080/imagesDir/jpg/232827/slide-3.jpg)
Этапы секвенирования
1. Выделение ДНК.
2. Создание геномной библиотеки (полногеномное секвенирование) или амплификация
участка ДНК (целевое секвенирование).
3. Секвенирование.
4. Анализ данных.
Слайд 5
![Геномные библиотеки (ДНК-библиотеки) Геномная библиотека – набор фрагментов одного генома,](/_ipx/f_webp&q_80&fit_contain&s_1440x1080/imagesDir/jpg/232827/slide-4.jpg)
Геномные библиотеки (ДНК-библиотеки)
Геномная библиотека – набор фрагментов одного генома, каждый фрагмент
уникален. Для секвенирования необходимо получение сигнала от множества идентичных фрагментов, поэтому из каждого фрагмента геномной библиотеки получают множество копий – клональная библиотека.
Методы получения геномных библиотек:
Клонирование в вектор
ПЦР
Слайд 6
![Клонирование в вектор](/_ipx/f_webp&q_80&fit_contain&s_1440x1080/imagesDir/jpg/232827/slide-5.jpg)
Слайд 7
![Создание ДНК-библиотек с помощью ПЦР](/_ipx/f_webp&q_80&fit_contain&s_1440x1080/imagesDir/jpg/232827/slide-6.jpg)
Создание ДНК-библиотек с помощью ПЦР
Слайд 8
![Концепция shotgun-секвенирования – получение геномных библиотек](/_ipx/f_webp&q_80&fit_contain&s_1440x1080/imagesDir/jpg/232827/slide-7.jpg)
Концепция shotgun-секвенирования – получение геномных библиотек
Слайд 9
![Целевое (таргетное) секвенирование В процессе приготовления библиотеки необходимо выделить только](/_ipx/f_webp&q_80&fit_contain&s_1440x1080/imagesDir/jpg/232827/slide-8.jpg)
Целевое (таргетное) секвенирование
В процессе приготовления библиотеки необходимо выделить только целевые участки
НК:
1). ПЦР со специфическими праймерами.
2). Гибридизация со специфическими олигонуклеотидами, меченными биотином – выделение на магнитных частицах, покрытых стрептавидином.
3). Выделение на магнитных частицах, покрытых антителами к белкам, связанным с целевой последовательностью (напр., гистон в ChIP-Seq).
Слайд 10
![Секвенирование по Максаму – Гилберту Основа метода – химическое расщепление](/_ipx/f_webp&q_80&fit_contain&s_1440x1080/imagesDir/jpg/232827/slide-9.jpg)
Секвенирование по Максаму – Гилберту
Основа метода – химическое расщепление множества копий
одной целевой молекулы ДНК в позициях определённых нуклеотидов.
Слайд 11
![Этапы секвенирования по Максаму – Гилберту 1). Получение множества копий](/_ipx/f_webp&q_80&fit_contain&s_1440x1080/imagesDir/jpg/232827/slide-10.jpg)
Этапы секвенирования по Максаму – Гилберту
1). Получение множества копий целевой последовательности
(100-1000 п.о.).
2). Мечение молекул ДНК на 5’-конце с помощью 32P-фосфата.
3). Разделение смеси на 4 части.
4). Двухстадийный гидролиз молекул в каждой части (4 реакции) по определённому основанию или двум химически близким основаниям.
5). Электрофорез с радиографической детекцией.
Слайд 12
![Химический гидролиз по основаниям](/_ipx/f_webp&q_80&fit_contain&s_1440x1080/imagesDir/jpg/232827/slide-11.jpg)
Химический гидролиз по основаниям
Слайд 13
![Схема метода Максама – Гилберта](/_ipx/f_webp&q_80&fit_contain&s_1440x1080/imagesDir/jpg/232827/slide-12.jpg)
Схема метода Максама – Гилберта
Слайд 14
![Характеристика секвенирования по Максаму – Гилберту Преимущества: Высокая точность Большая](/_ipx/f_webp&q_80&fit_contain&s_1440x1080/imagesDir/jpg/232827/slide-13.jpg)
Характеристика секвенирования по Максаму – Гилберту
Преимущества:
Высокая точность
Большая длина прочтения (300-1000 п.о.)
Не
требует знания концевых нуклеотидов целевой последовательности (не нужны праймеры)
“Не боится” вторичных структур ДНК
Недостатки:
Низкая производительность
Высокая стоимость в пересчёте на производительность
Высокая трудоёмкость и опасность работы
Практически не используется (“проигрывает другим методам”)
Слайд 15
![Основа метода Сэнгера: терминация синтеза [ddNTP]/[dNTP]=1/20](/_ipx/f_webp&q_80&fit_contain&s_1440x1080/imagesDir/jpg/232827/slide-14.jpg)
Основа метода Сэнгера: терминация синтеза
[ddNTP]/[dNTP]=1/20
Слайд 16
![Классическая схема Сэнгера (1977 год)](/_ipx/f_webp&q_80&fit_contain&s_1440x1080/imagesDir/jpg/232827/slide-15.jpg)
Классическая схема Сэнгера (1977 год)
Слайд 17
![Автоматическое секвенирование по Сэнгеру (1990 год)](/_ipx/f_webp&q_80&fit_contain&s_1440x1080/imagesDir/jpg/232827/slide-16.jpg)
Автоматическое секвенирование по Сэнгеру (1990 год)
Слайд 18
![Автоматический секвенатор (генетические анализатор) (Applied Biosystems 3500 xL)](/_ipx/f_webp&q_80&fit_contain&s_1440x1080/imagesDir/jpg/232827/slide-17.jpg)
Автоматический секвенатор (генетические анализатор) (Applied Biosystems 3500 xL)
Слайд 19
![Генетический анализатор с капиллярным электрофорезом изнутри](/_ipx/f_webp&q_80&fit_contain&s_1440x1080/imagesDir/jpg/232827/slide-18.jpg)
Генетический анализатор с капиллярным электрофорезом изнутри
Слайд 20
![Капиллярный электрофорез](/_ipx/f_webp&q_80&fit_contain&s_1440x1080/imagesDir/jpg/232827/slide-19.jpg)
Слайд 21
![Лазерная детекция флюоресценции](/_ipx/f_webp&q_80&fit_contain&s_1440x1080/imagesDir/jpg/232827/slide-20.jpg)
Лазерная детекция флюоресценции
Слайд 22
![Параметры метода (платформы) секвенирования Длина прочтения (длина рида, read length)](/_ipx/f_webp&q_80&fit_contain&s_1440x1080/imagesDir/jpg/232827/slide-21.jpg)
Параметры метода (платформы) секвенирования
Длина прочтения (длина рида, read length)
Производительность (выход, output)
Уровень
ошибки
Время одного запуска
Количество образцов на один запуск
Стоимость секвенирования
Слайд 23
![Секвенирование по Сэнгеру: Длина прочтения (длина рида) Результат секвенирования –](/_ipx/f_webp&q_80&fit_contain&s_1440x1080/imagesDir/jpg/232827/slide-22.jpg)
Секвенирование по Сэнгеру:
Длина прочтения (длина рида)
Результат секвенирования – набор последовательностей (прочтений)
сходной длины.
Длина рида для метода Сэнгера составляет до 1000 п.о.
Фрагмент ДНК “читается” не целиком, если он слишком большой (при форезе сложнее различить 50 и 51 п.о., чем 500 и 501 п.о.)
Слайд 24
![Секвенирование по Сэнгеру: Выход секвенирования (производительность) Выход равен количеству прочитанных](/_ipx/f_webp&q_80&fit_contain&s_1440x1080/imagesDir/jpg/232827/slide-23.jpg)
Секвенирование по Сэнгеру:
Выход секвенирования (производительность)
Выход равен количеству прочитанных нуклеотидов за один
запуск:
O=l*n
l – средняя длина рида
n – количество ридов за запуск
Метод Сэнгера: 70-96 кбаз (кб, kb) (ср.: геном человека ~ 3 Gb)
Слайд 25
![Секвенирование по Сэнгеру: Количество образцов на один запуск Количество образцов](/_ipx/f_webp&q_80&fit_contain&s_1440x1080/imagesDir/jpg/232827/slide-24.jpg)
Секвенирование по Сэнгеру:
Количество образцов на один запуск
Количество образцов определяется исходя из
выхода секвенирования и размера секвенируемых последовательностей.
Для метода Сэнгера количество образцов не может быть больше количества капилляров в автоматическом анализаторе (т.е. ≤96).
Слайд 26
![Секвенирование по Сэнгеру: Уровень ошибки секвенирования Уровень ошибки – доля](/_ipx/f_webp&q_80&fit_contain&s_1440x1080/imagesDir/jpg/232827/slide-25.jpg)
Секвенирование по Сэнгеру:
Уровень ошибки секвенирования
Уровень ошибки – доля нуклеотидов, прочитанных ошибочно
(%).
Источники ошибок в методе Сэнгера:
1). Качество ридов начинает падать ближе к концу (после 700 нуклеотида), т.к. форез не позволяет различать длинные фрагменты, отличающиеся на 1 нуклеотид.
2). Плохо секвенируются гомополимеры (..TTTTTT..), т.к. их сигналы могут сливаться.
Уровень ошибки в методе Сэнгера: 0,1-1% (самый точный метод!)
Слайд 27
![Секвенирование по Сэнгеру: Время одного запуска 2-3 часа: – 2](/_ipx/f_webp&q_80&fit_contain&s_1440x1080/imagesDir/jpg/232827/slide-26.jpg)
Секвенирование по Сэнгеру:
Время одного запуска
2-3 часа:
– 2 часа на терминирующую ПЦР
–
40 минут на электрофорез
Метод позволяет запускать генетический анализатор бесперебойно в течение 48 часов.
Слайд 28
![Секвенирование по Сэнгеру: Стоимость (в пересчёте на производительность) Самый дорогой](/_ipx/f_webp&q_80&fit_contain&s_1440x1080/imagesDir/jpg/232827/slide-27.jpg)
Секвенирование по Сэнгеру:
Стоимость (в пересчёте на производительность)
Самый дорогой метод: стоимость выше
~ в 10 тыс. раз (!) по сравнению с другими методами (в пересчёте на производительность).
Основная статья расходов – реагенты для терминирующей ПЦР (флюоресцентно меченные ddNTP)
Слайд 29
![Характеристика секвенирования по Сэнгеру Преимущества: Низкая частота ошибок (0,1-1%) Большая](/_ipx/f_webp&q_80&fit_contain&s_1440x1080/imagesDir/jpg/232827/slide-28.jpg)
Характеристика секвенирования по Сэнгеру
Преимущества:
Низкая частота ошибок (0,1-1%)
Большая длина прочтения (300-1000 п.о.)
Недостатки:
Низкая
производительность
Высокая стоимость в пересчёте на производительность
Высокая трудоёмкость