Использование иммунологических реакций: реакции агглютинации, гемагглютинации, связывания комплемента, нейтрализации презентация

Реакция агглютинации. Компоненты, механизм, способы постановки. Применение.
Реакция агглютинации — простая по постановке реакция, при которой происходит связывание антителами корпускулярных антигенов (бактерий, эритроцитов или других клеток, нерастворимых частиц с адсорбированными на них антигенами, а также макромолекулярных агрегатов). Она протекает при наличии электролитов, например при добавлении изотонического раствора натрия хлорида.
Применяются различные варианты реакции агглютинации: развернутая, ориентировочная, непрямая и др. Реакция агглютинации проявляется образованием хлопьев или осадка (клетки, «склеенные» антителами, имеющими два или более антигенсвязывающих центра.

Ориентировочная реакция агглютинации на стекле. К капле агглютинирующей сыворотки (разведение 1 : 20) добавляют взвесь бактерии, выделенных от больного животного. Образуется хлопьевидный осадок.
Для ее постановки на поверхность обычного предметного стекла (или в лунки специальных стекол) наносят капли цельной или незначительно разведенной сыворотки и затем вносят в каждую каплю корпускулярный антиген в растворе электролита (например, физиологическом растворе). В качестве контролей на стекло должны быть нанесены отдельные капли, содержащие только антиген или только сыворотку. В случае соответствия антигена антителам сыворотки в опытных каплях в течение 5–15 мин образуется видимый глазом осадок, который не наблюдается в контрольных каплях. В такой реакции неизвестным может быть антиген (например, выделенные в ходе исследования бактерии), и в этом случае используются промышленно производимые антисыворотки, содержащие антитела к антигенам бактерий конкретных видов или сероваров (серотипов, серогрупп). Применить эту реакцию можно и для анализа сыворотки, полученной, например, от конкретного пациента. В этом случае используются промышленно производимые взвеси антигенов, называемые обычно диагностикумами.

Развернутая реакция агглютинации.
Применение этой реакции основано на обсужденных ранее особенностях агглютинации: хорошо фиксируемые визуально комплексы образуются только при соответствующих концентрациях реагирующих антигенов и антител. Для постановки реакции анализируемую сыворотку разводят физиологическим раствором в зависимости от предполагаемого в ней количества анализируемых антител либо в 10 или в 100 раз, а затем несколько раз двукратно, либо сразу начинают с серии последовательных двукратных разведений. Пробирок с минимальным разведением сыворотки обычно приготавливают две – одна из них будет служить в качестве контроля на выпадение в осадок самой сыворотки. Кроме того, готовят одну пробирку, в которой будет содержаться только используемый для разведения сыворотки физиологический раствор. Объем жидкости во всех пробирках должен быть одинаковым. Далее в каждую пробирку (кроме контрольной на выпадение в осадок сыворотки) вносят равные объемы суспензии антигена в таком же физиологическом растворе, перемешивают и помещают в термостат с температурой 37ºС на 1–4 часа. При отсутствии видимых осадков после инкубирования в термостате, как правило, оставляют пробирки при комнатной температуре до следующего дня. Учет результатов проводят визуально, отмечая, при каких разведениях сыворотки образуются осадки. Наибольшее разведение (например, 1 : 3200), при котором осадок образовался, считается показателем и называется титром сыворотки.

Развернутая реакция агглютинации с возбудителем, выделенным от больного животного. К разведениям агглютинирующей сыворотки добавляют взвесь бактерий, выделенных от больного.
Развернутая реакция агглютинации с сывороткой крови. К разведениям сыворотки добавляют диагностикум.
Агглютинация с О-диагностикумом (бактерии, убитые нагреванием, сохранившие O- антиген) происходит в виде мелкозернистой агглютинации.
Агглютинация с Н - диагностикумом (бактерии, убитые формалином, сохранившие жгутиковый Н-антиген) - крупнохлопчатая и протекает быстрее.

Прямая гемагглютинация. Реакция прямой гемагглютинации (РПГА) используется для выявления поверхностных антигенов микроорганизмов и эритроцитов, а также антител к ним.
К стандартным сывороткам, содержащим антитела, добавляют исследуемый материал (кровь). Скорость прямой реакции агглютинации связана с количеством исследуемого материала, количеством и концентрацией сыворотки, температурой окружающей среды.
Непрямая гемагглютинация. Реакцию непрямой гемагглютинации проводят для выявления антител в крови пациента с помощью эритроцитарного диагностикума. Реагент представляет собой эритроциты, на поверхности которых расположен антиген (белки микроорганизмов, токсинов, аллергенов и др.).
Сыворотку крови пациента разводят 0,9 %-ным раствором натрия хлорида, затем добавляют эритроцитарный диагностикум и отслеживают результат. Этот высокочувствительный способ диагностики выявляет антигены даже в небольших концентрациях.
Реакции гемагглютинации.
Собственно феномен гемагглютинации заключается в объединении эритроцитов в видимые невооруженным глазом агрегаты и более быстром, чем оседание свободных эритроцитов, осаждении их из раствора. Помимо открытых еще К. Ландштейнером агглютининов α и β агрегирование эритроцитов могут вызывать антитела к различным эритроцитарным антигенам, лектины растительного происхождения, антигены и жгутики бактерий некоторых видов, некоторые вирусы, в том числе и вирусы человека.

Осаждение эритроцитов лучше всего наблюдать в небольших объемах, вносимых в специальные углубления (лунки) на поверхности стеклянных пластинок или полистироловых планшетов для иммунологических реакций. Дно таких углублений имеет форму сферы, поэтому при естественном (без агглютинации) оседании эритроцитов на дне такой лунки в центре образуется плотный осадок с ровными краями, занимающий небольшую площадь (так называемая «пуговка»). Такой результат в реакциях учитывают как отрицательный. При наличии агглютинации в зависимости от ее степени осадок появляется на большей, чем «пуговка», площади и края осадка выглядят размытыми. При самой эффективной агглютинации осадок покрывает практически все сферическое дно, формируя так называемый «зонтик» (название связано со сходством наблюдаемой картины с красным перевернутым зонтом).

Реакция Кумбса — антиглобулиновый тест для определения неполных антиэритроцитарных антител. Тест Кумбса используется для выявления антител к резус-фактору у беременных женщин и определения гемолитической анемии у новорождённых детей с резус-несовместимостью, влекущей разрушение эритроцитов. Основы метода описаны в 1908 году Мореши, в 1945 году - Кумбсом, Мураном и Рэйсом,впоследствии получил название «реакция Кумбса».
Прямая реакция. Антитела, находящиеся на поверхности эритроцитов, могут быть как в статичном, так и в свободном состоянии в плазме крови. В зависимости от состояния антител проводится прямая или непрямая реакция Кумбса. Если есть основания для предположения, что антитела зафиксированы на поверхности эритроцитов, проводится прямой тест Кумбса. В этом случае тест проходит в один этап — добавляется антиглобулиновая сыворотка. Если на поверхности эритроцитов присутствуют неполные антитела, происходит агглютинация эритроцитов.
Непрямая реакция. Кумбса протекает в 2 этапа. Сначала необходимо искусственно осуществить сенсибилизацию эритроцитов. Для этого эритроциты и исследуемую сыворотку крови инкубируют, что вызывает фиксацию антител на поверхности эритроцитов. После чего проводится второй этап теста Кумбса — добавление антиглобулиновой сыворотки.

Гемагглютинацию можно использовать для выявления определенных возбудителей болезней и антител, вырабатываемых под их воздействием. В первом случае ставится реакция прямой активной гемагглютинации. Например, для выявления в анализируемой жидкости пара- и ортомиксовирусов ее смешивают с 1 % суспензией отмытых физиологическим раствором куриных эритроцитов. Их агглютинация будет свидетельствовать о наличии вируса. Такая реакция фактически не относится к реакциям с применением антител, поскольку здесь собственно вирусы являются агглютинирующим фактором. Во втором случае используется торможение (ингибирование) геамагглютинации. Для ее постановки в систему прямой гемагглютинации, содержащую конкретный гемагглютинирующий вирус и куриные эритроциты, вносят анализируемую сыворотку.

Реакция связывания комплемента (РСК)
Реакция связывания комплемента (РСК) заключается в том, что при соответствии друг другу антигенов и антител они образуют иммунный комплекс, к которому через Fc-фрагмент антител присоединяется комплемент (С), т.е. происходит связывание комплемента комплексом антиген - антитело. Если же комплекс антиген - антитело не образуется, то комплемент остается свободным. PCK проводят в две фазы 1-я фаза - инкубация смеси, содержащей антиген + антитело + комплемент, 2-я фаза (индикаторная) - выявление в смеси свободного комплемента путем добавления к ней гемолитической системы, состоящей из эритроцитов барана, и гемолитической сыворотки, содержащей антитела к ним. В 1-й фазе реакции при образовании комплекса антиген - антитело происходит связывание им комплемента, и тогда во 2-й фазе гемолиз сенсибилизированных антителами эритроцитов не произойдет (реакция положительная). Если антиген и антитело не соответствуют друг другу (в исследуемом образце нет антигена или антитела), комплемент остается свободным и во 2-й фазе присоединится к комплексу эритроцит - антиэритроцитарное антитело, вызывая гемолиз (реакция отрицательная).

Реакции нейтрализации.
Эта группа реакций была введена в практику одной из первых, еще в конце XIX века, но до сих пор не утратила своей актуальности. С помощью реакций нейтрализации можно выявлять наличие антител и оценивать эффект их действия, а также идентифицировать микроорганизмы или их факторы патогенности. Особенностью реакций этой группы является использование для визуализации результатов взаимодействия антиген-антитело живых тест-систем. Под этим термином понимают целостный организм взрослого животного, куриные эмбрионы, поддерживаемые в культуре клетки животных или человека. Выбор тест-системы определяется, прежде всего, свойствами антигенов, которые используются в конкретной реакции.

Реакции нейтрализации могут быть использованы для идентификации патогенных микроорганизмов и определения их количества в анализируемых пробах. В этом случае необходимо наличие антисывороток или суспензий моноклональных антител, специфичных по отношению к конкретным видам или штаммам. Испытываемую жидкость смешивают с антителами, выдерживают необходимое для взаимодействия антиген-антитело время, и вводят в живую тест-систему. В качестве контроля используют введение в такую же тест-систему смеси нормальной сыворотки и анализируемой пробы. Сравнивая состояние тест-систем в опыте и контроле, делают вывод о наличии или отсутствии нейтрализации и, соответственно, о видовой или штаммовой принадлежности патогена. Для некоторых микроорганизмов, в частности, болезнетворных вирусов, реакции нейтрализации до сих пор являются фактически единственным методом их идентификации.
Практически такой же метод может быть использован для оценки иммунного ответа организма на присутствие возбудителя, но в этом случае используются стандартные штаммы микроорганизмов и сыворотки крови пациента или иммунизированного животного.

По сходному принципу осуществляются и реакции, позволяющие исследовать не микроорганизмы, а их токсины и обладающие антитоксическим действием антитела (антитоксины). В таких реакциях различают варианты in vitro и in vivo. Первый практически не отличается от реакций, описанных выше, а при втором используют в качестве опытной тест-системы иммунизированных таким токсином животных и в качестве контрольной - интактных животных. Фактически тесты на определение уровня антитоксического иммунитета у людей (проба Дика при скарлатине или реакция Шика при дифтерии) также являются вариантом реакции нейтрализации токсинов in vivo.
Если реакции проводятся как количественные (т. е. с соблюдением упомянутых выше правил), то результатом их будет индекс нейтрализации.
К реакциям нейтрализации относят и такие, в которых исследуются факторы патогенности бактерий, являющиеся не токсинами, а ферментами (лецитиназами, гиалорунидазами, коллагеназами и др.) или специфичные по отношению к ним антитела. Отличительной чертой этой группы реакций нейтрализации является то, что в них не используются живые тест-системы, а для визуализации результатов взаимодействия антиген-антитело достаточно проверки воздействия фермента на его субстрат.

ИММУНОМАГНИТНАЯ СЕПАРАЦИЯ
Необходимым условием проведения иммуномагнитной сепарации клеток-мишеней из суспензии является наличие:
- иммуномагниточувствительных микросфер (ИММС);
- моноклональных антител (МКАТ);
- магнитного сепаратора;
- лабораторного оборудования, посуды и растворов.
Магниточувствительные микросферы
Магниточувствительные микросферы (ММС) являются суперпарамагнитными монодисперсными полимерными частицами. Они содержат в своей структуре равномерно распределенный по объему магнитный материал, который под действием внешнего магнитного поля приобретает собственый магнитный момент (намагничивается до насыщения). Полимер тонким слоем покрывает частицы магнетита и определяет поверхностные характеристики микросфер (форму, размер). Микросферы являются твердофазными носителями МКАТ. Они конъюгированы с панелью моно- поликлональных антител, обладающих специфической иммунологической восприимчивостью к определенным клеткам в зависимости от наличия на их поверхности типа кластеров дифференцировки — CD. Это дает возможность образовывать комплексы микросферы — клетка (КМК) посредством связи антиген-антитело, а наличие включения в них магнетита позволяет быстро и избирательно выделять КМК с помощью магнитного сепаратора.

Различают:
Первичнопокрытые ММС (ПММС). Готовы к использованию и добавляются непосредственно к клеточной суспензии. Они могут быть покрыты первичными МКАТ, которые прямо посажены на поверхность микросферы, или через вторичные антитела, специфические к первичным.
Вторичнопокрытые ММС (ВММС). Различные мышиные, крысиные или кроличьи поликлональные или моноклональные антитела, которые могут быть использованы в клеточной сепарации после инкубации их с ВММС.
Непокрытые активированные ММС (АММС). На АММС перед экспериментом могут быть посажены специфические поли- или моноклональные антитела и лиганды.
Типы иммуномагнитной сепарации.
Прямой метод — при котором магнитные микросферы, первично покрытые МКАТ, добавляют непосредственно к суспензии клеток. В процессе инкубации образуются комплексы ИММС с клетками-мишенями. Эти комплексы могут быть удалены из суспензии с помощью магнитного сепаратора.
Непрямой метод — при этом методе клетки-мишени метятся первичными MKT, которые добавляют к суспензии клеток. После периода инкубации свободные несвязавшиеся МКАТ отмывают центрифугированием и только затем к этой суспензии клеток добавляют магнитные микросферы, покрытые вторичными моно- или поликлональными антителами.

В процессе инкубации ВММС связываются с клетками, меченными первичными МКАТ. Эти комплексы также могут быть удалены с помощью магнитного сепаратора. Таким образом, прямой метод более экономичен по использованию количества МКАТ и времени для проведения полной сепарации, однако непрямой метод более эффективен при одновременном выделении нескольких клеток-мишеней из суспензии.
Позитивная сепарация — выделение и концентрация интересующих клеток из исследуемого объекта. Она используется обычно в прямом методе и позволяет выделять клетки с высокой степенью очистки.
Негативная сепарация — метод, с помощью которого клеточная популяция очищается путем удаления всех других типов клеток из исследуемого материала. Негативная изоляция может быть проведена как прямым, так и непрямым методом.
Достоинства метода
Высокий уровень корреляции с проточной цитометрией
Высокая чувствительность: 10-20 клеток на мкл
Экономичность, нет необходимости в дорогостоящем оборудовании
Абсолютный счет, нет необходимости в определении формулы крови
Нет необходимости в калибровке, возможность исследования единичных образцов
Хорошая внутрилабораторная и межлабораторная воспроизводимость результатов
Время анализа: 45-60 минут
Готовые к использованию реагенты
Легкость в освоении

Технология магнитной сепарации для Т-клеточной иммунотерапии
В настоящее время становятся достаточно актуальными исследования, посвященные возможности использования аутологичных и геннномодифицированных Т-клеток в комплексной терапии ряда опухолей и злокачественно протекающих инфекций. По данным зарубежных авторов, приведенным в таблице, Т-клеточная иммунотерапия доказала свою эффективность в ряде тяжелых иммунологических заболеваний.

Для выделения специфичной Т-клеточной популяции и ее пролиферации традиционно использовали достаточно длительную процедуру концентрации и
культивирования Т-клеток в сочетании с антигенной стимуляцией. Благодаря развитию технологии иммуномагнитной сепарации сегодня появился новый методологический подход к получению Т-клеток с целью их пролиферации и генетической модификации для Т-клеточной иммунотерапии. В системе in vivo распознавание антигена и активация Т-клетки происходит посредством поверхностных рецепторов CD3 и CD28.
Технология иммуномагнитной активации Dynal основана на использовании специальных парамагнитных частиц Dynabeads ClinExVivo CD3/CD28, при
контакте с которыми T-лимфоциты получают сигнал к активации и пролиферации. Для обеспечения стерильных условий выделения и культивирования вся процедура осуществляется на базе специализированной магнитной установки Dynal ClinExVivo МРС.

• Цельную кровь, костный мозг или лимфоцитарную суспензию помешают на стойке для первичного биоматериала. Затем добавляют реагент Dynabeads
ClinExVivo CD3/CD28
• Смесь инкубируют при постоянном перемешивании 30 мин.
• Образовавшиеся Dynabeads-клеточные комплексы фиксируются на основной магнитной платформе DynalClinExVivo МРС; не связавшаяся с частицами фракция переносится во вторичный мешок для сбора супернатанта.
• В мешок, содержащий связанные с частицами клетки, добавляют культуральную среду. Целевые клетки переносят в культуральный бокс для Т-клеточной пролиферации.