Микробиологические методы лабораторной диагностики инфекционных заболеваний презентация

диагностику
инфекционных заболеваний
микробиологические
методы исследования
направлены на

цель микробиологических исследований: установить факт
наличия или отсутствия возбудителя инфекционных заболеваний
в организме больного
или на объектах внешней среды

задачи микробиологических исследований:
обнаружить инфекционного агента в исследуемом материале
идентифицировать микробного агента
интерпретировать результаты исследования

основу микробиологической диагностики составляет
правильный отбор биологического материала
для исследования

выбор материала для исследования должен соответствовать:
►патогенезу заболевания

выбор материала для исследования должен соответствовать:
►биологическим свойствам возбудителя

выбор материала для исследования должен соответствовать:
►эпидемиологии возбудителя

клинический материал отбирают в соответствие с локализацией инфекции в организме больного (при поражениях отдельных органов и систем)

при отсутствии клинически выраженного инфекционного поражения исследуют кровь, а затем отбирают образцы биологического материала с учётом клинической картины заболевания и доступности взятия материала для исследования

образцы клинического материала забирают до начала антимикробной терапии с соблюдением правил асептики

каждый клинический материал следует рассматривать как потенциально опасный, вследствие этого при заборе, транспортировке, хранении и работе с ним необходимо соблюдать правила биологической безопасности
общие требования к процедуре
отбора и транспортировки:

клинический материал следует забирать в объёме, достаточном для всего комплекса микробиологических исследований
общие требования к процедуре
отбора и транспортировки:

микробиологические исследования следует начинать немедленно после поступления образца в микробиологическую лабораторию
общие требования к процедуре
отбора и транспортировки:

требования к транспортировке
термоконтейнер:
лед
ледяная вода
сухой лед
или
+ 37°C
► неизменность образца
►своевременность доставки
исследуемого материала в лабораторию

направление
Министерство здравоохранения Код формы по ОКУД
Наименование учреждения: Код учреждения по ОКПО Областная клиническая больница Медицинская документация
г. Иркутск, ул. Юбилейный 100. Форма N 204/У
Утверждена Минздравом СССР
04.10.80 N 1030
Направление
на микробиологическое исследование
"____"_________________20___г.___________час____мин___________
в_______________________________ лабораторию
Ф.И.О. ____________________________ возраст ____________________
Медицинская карта N _________________________________________
Отделение _______________ палата _____________________________
Диагноз, дата заболевания: _____________________________________
Показания к обследованию: больной, переболевший, реконвалесцент,
контактный, профилактическое обследование (подчеркнуть, вписать)
______________________________________________________________
Материал: кровь, моча, мокрота, кал, дуоденальное содержимое,
пунктат, мазок, соскоб, раневое содержимое, гной, секционный материал,
______________________________________________________________
Цель и наименование исследования:_____________________________
(на какие инфекции исследовать)
Должность и фамилия лица, направляющего материал: __________
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Результат исследования №_____
При исследовании______________________________________________
(наименование материала)
______________________________________________________________
Дата выдачи:”_____”_________20_____г. Подпись_________________

микробиологические
методы
исследования:

микробиологические
методы исследования
прямое обнаружение возбудителя
инфекционного заболевания
в клиническом материале обследуемого
косвенное определение возбудителя инфекционного заболевания
в клиническом материале обследуемого
направлены на:
клинический материал
адекватный метод исследования

прямое обнаружение возбудителя
инфекционного заболевания
в клиническом материале обследуемого:

микроскопический метод это самостоятельный метод исследования, позволяющий определить в клиническом материале обследуемого возбудителя инфекционного заболевания на основе морфологических особенностей
микробной клетки

Задачи
микроскопии:
выявление возбудителя в клиническом материале
идентификация на основе определения характерных морфологических и тинкториальных признаков микроорганизмов
изучение окрашенных мазков из колоний чистых культур.

Микро-
организмы
Морфология
Специальное расположение клетки в мазке
Тинкториальные свойства
Наличие специфических органоидов
ь

Простые методы окраски микроорганизмов
Особенность метода
Одноэтапность
Окраска одним красителем
Назначение метода
Изучение формы микроорганизмов
Изучения взаимного расположения
Изучение величины микроорганизмов

Сложные методы окраски микроорганизмов
Особенность метода
Многоэтапность
Окраски двумя красителями
Использование протравы и дифференцирующие вещества
Назначение метода
Дифференцирование одних видов микроорганизмов другими
Изучение структуры микроорганизмов

Дифференцирование одних видов от других
Метод Грама
Отличие Г+ от Г- бактерий
Метод Циль-Нильсона
Отличие кислотоустойчивых от кислотонеустойчивых
Метод Романовского-Гимзы
Дифференцирование микроорганизмов (спирохет)
Выявление нуклеотида
Обнаружение простейших

Изучение структуры микроорганизмов
Метод Ожешко
Метод Леффлера
Метод Нейссера
Метод Гинса
Выявление спор
Выявление зерен
Выявление капсул
Выявление жгутиков

микроскопический метод включает:
исследуемый
материал
I ЭТАП
ПРИГОТОВЛЕНИЕ МАЗКА-ПРЕПАРАТА
для определения в нем
инфекционного агента
(вид мазка зависит от клинического материала)

исследуемый
материал
виды мазков:
(вид мазка зависит от цели исследования)

прижизненное определение микробов проводят
при микроспопии
в темном поле или фазово-контрастным методом
нативные препараты
готовят для исследования
живых неокрашенных бактерий

для приготовления фиксированных препаратов в зависимости от клинического материала используют разные методы фиксации мазка
фиксация
химическая
мазки погружают на 5-20 мин.
►в метиловый
► этиловый спирт
► смесь Никифорова
► сулемовый спирт
► другие фиксирующие жидкости
Физическая
мазки фламбируют через пламя спиртовки 3 раза

II ЭТАП
ОКРАШИВАНИЕ ПРЕПАРАТА
(в зависимости от цели исследования)

- метод Грама
- метод Циля – Нильсена
- метод Романовского-Гимзе
дифференцирующие методы:
(позволяют выявить тинкториальные свойства микробов)

мазок из чистой культуры
Klebsiella pneumoniae
специальные методы окраски применяют для окрашивания различных морфологических структур:
окраска по Бурри-Гинсу для обнаружения капсул
на темном фоне препарата контрастно выделяются неокрашенные капсулы, внутри которых находятся бактерии ярко-малинового цвета

для обнаружения жгутиков используют прямой метод Леффлера
или темнопольную и фазово-контрастную микроскопию

метод Ожешко позволяет обнаружить споры
споры B. anthracis, окрашены в рубиново-красный цвет, палочки – в фиолетовый

III ЭТАП
МИКРОСКОПИЯ ПРЕПАРАТА

ЗАКЛЮЧЕНИЕ ПО РЕЗУЛЬТАТАМ ИССЛЕДОВАНИЯ
IY ЭТАП

эффективность обнаружения микроорганизмов в мазке-препарате определяется степенью обсемененности им исследуемого материала: если при обсемененности:
> 106 кл/мл –
обнаружение микроорганизмов не встречает затруднений
104 кл/мл
обнаружение становится трудно разрешимой задачей
< 103 кл/мл
обнаружение фактически неразрешимо

идентификационные критерии микроскопического метода :

морфологические особенности
микробной клетки возбудителя к числу которых относятся
►специфическая форма микробной клетки

►наличие необязательных органоидов в структуре микробной клетки

►специфическое расположение микробных клеток
в мазке

► тинкториальные свойства

Пример:
возбудитель сифилиса
(серонегативный период)
фиксированный мазок
микроскопия в темном поле – специфическое движение
серебрение по Морозову
- количество завитков
мазок висячая или раздавленная капля
фиксированный мазок
окраска по Романовскому-Гимзе
- тинкториальные свойства

культуральный метод исследования – метод выделения чистой культуры возбудителя и ее идентификация на основе комплекса
его биологических свойств

культуральньй метод является «золотым стандартом» и составляет один из основных видов работы микробиологической лаборатории

алгоритм
культурального метода исследования:

I ЭТАП
посев исследуемого материала
для выделения чистой культуры

II ЭТАП
накопление чистой культур

III ЭТАП
постановка идентификационных тестов с целью дифференцирования инфекционного агента

определение комплекса биологических свойств выделенной культуры
с целью ее идентификации
IY ЭТАП
морфология
микробной клетки
тинкториальные свойства
микробной клетки
культуральные свойства
биохимические свойства

определение комплекса биологических свойств выделенной культуры
с целью ее идентификации
IY ЭТАП

определение чувствительности антимикробным препаратам

разрешающая способность метода
► повышенные требования
к транспортировке и хранению клинического материала
►длительные сроки
культивирования микроорганизмов
► не все виды микроорганизмов
можно культивировать
in vitro

непрямое обнаружение возбудителя
инфекционного заболевания
в клиническом материале обследуемого:

иммунологический метод - это метод косвенного определения инфекционного агента на основе ответной реакции организма
на его присутствие

МЕТОД СЕРОДИАГНОСТИКИ - это метод, целью которого является обнаружение в сыворотке обследуемого антител к возбудителю инфекционного заболевания
МЕТОД СЕРОДИАГНОСТИКИ
in vitro
in vivo

Содержание:
Основные определения. Цель исследования.
На чем основаны и как проводятся исследования?

МЕТОД СЕРОДИАГНОСТИКИ
in vitro
исследуемый материал
- сыворотка крови

Основные определения.
Серологический метод представляет собой способ лабораторного исследования определенных специфических белков (антител и антигенов) в сыворотке крови пациента, основанный на иммунных реакциях организма.

Антигенами - называют вещества любого происхождения, которые распознаются клетками иммунной системы организма реципиента как генетически чужеродные и вызывают различные формы иммунного ответа.
Антитела – это защитники организма от инфекционного, вообще от любого чужеродного вещества (антигена).

Серологические реакции характеризуются:
Специфичностью, под которой понимают способность антигенов реагировать только с гомологичными антителами
2.Чувствительностью, которая характеризуется минимальным количеством антигенов или антител, которое выявляет данная реакция.

На чем основаны и как проводятся исследования?
Серологические исследования основаны на физиологичеком феномене – образовании в организме, в сыворотке крови антител в ответ на попадание в организм чужеродного белка (антигена) – микроба, вируса, измененных тканей организма
Антитела соединяются с антигеном, растворяют его, «склеивают» или обезвреживают другими путями. На основании этих процессов были предложены исследования сыворотки, которые позволяют распознавать инфекционный процесс.

В первую очередь для проведения серологического анализа используют биологический материал, собранный от пациента:
сыворотка крови
слюна
фекальные массы
Данный анализ не требует специальной подготовки пациента. Забор исследуемого материала, например крови, проводится утром натощак и, производится в процедурных кабинетах лечебных учреждений, согласно общепринятым гематологическим методикам.

Общая схема серологических исследований :

Если имеются стандартные образцы антигена (возбудителя какого-либо заболевания, клеток измененной ткани), а в сыворотке крови больного обнаруживаются антитела к этому антигену, можно сделать вывод, что человек болен данной болезнью. Судят о том, есть ли антитела, по тем реакциям, в которых они участвуют с данным антигеном. На рисунке приведен пример реакции агглютинации, склеивания, появления помутнения сыворотки крови.

Кровь наливается в ряд пробирок и разводится физиологическим раствором в разных разведениях. Затем в каждую пробирку добавляется стандартный, известный антиген, микроб или вирус. Смотрят, в каком из наибольших разведений мутнеет сыворотка – это и будет титр реакции для данного больного.
Чем титр больше, тем больше вероятность заболевания. Поэтому говорят о диагностически значимых титрах для болезни, потому что более низкие титры могут просто говорить о случайной встрече человека с данным микробом, но без болезни.

Есть еще метод исследования т.н. парных сывороток, когда кровь больного исследуется в начале заболевания и через 2 – 3 недели. Вначале антител может не быть, а в более поздних стадиях титр может повышаться. Это также свидетельствует о наличии болезни.

критерии этиологической значимости инфекционного агента
в методе серодиагностике
►диагностический титр

► динамика антителообразования
в парных сыворотках

► циркуляция в крови иммуноглобулинов
разных классов
Ig G 1:400
Ig M -
Ig G 1:200
Ig M 1:400

Серологические исследования включают в себя различные серологические реакции:
1. Реакция агглютинации.
2. Реакция преципитации.
3. Реакция нейтрализации.
4. Реакция с участием комплемента.
5. Реакция с использованием меченых антител или антигенов.

МЕТОД СЕРОДИАГНОСТИКИ
in vivo
проба Дика
проба Шика
проба Манту
наличие АТ в сыворотки крови обследуемого
наличие t-сенсибилизированных лимфоцитов к АГ в сыворотки крови обследуемого

Информативность метода.
Серологические методы высокоинформативные для распознавания причин миокардитов, болезни легионеров, атипичных пневмоний, кишечных инфекций, вирусных гепатитов.
Они используются также для диагностики так называемых аутоиммунных заболеваний, когда в организме человека некоторые ткани так изменяют свои свойства, что становятся для него чужеродными. В ответ на это в организме образуются антитела против этих структур.
Выявление такого рода антител в сыворотке крови позволяет диагностировать эти серьезные болезни.

экспресс методы
исследования

направлено на выявление возбудителя инфекционного заболевания
в исследуемом материале
на основе:

антигенных свойств

сероидентификация
РИФ

МЕТОД ИММОБИЛИЗАЦИИ
мазок висячая капля
движение
диагностическая сыворотка
+
иммобилизация движения
мазок висячая капля

молекулярно-генетический метод позволяющий дифференцировать инфекционного агента в клиническом материале
на основе стабильного участка нуклеиновой кислоты

Молекулярно-генетические методы
Полимеразная цепная реакция (PCR)
Методика разветвленных зондов (branched DNA)
Транскрипционно-опосредованная амплификация Nucleic Acid Sequence Based Amplification (NASBA)
Амплификация с вытеснением цепи (SDA)
Гибридный захват (HC)
Лигазная цепная реакция (LCR)
Другие...
QB репликаза, Биочипы

в основе
молекулярно-генетических методов исследования лежит уникальное свойство НК - способность к саморепродукции, комплементарному достраиванию матрицы

ДНК – универсальный носитель генетической
информации и наследственных признаков у всех существующих на Земле организмов.
95% генетической информации содержится в ядре клетки, в виде хромосом (комплекса ДНК и белков)
У человека ядерная ДНК находится в виде 46 хромосом (23 пары), из которых 22 соматические и две половые X и Y.
5% генетической информации содержится в органеллах цитоплазмы – митохондриях.
Исключение - вирусы, которые могут нести как РНК, так и ДНК

в начале 1970-х годов
норвежский учёный
Хьелль Клеппе
из лаборатории нобелевского лауреата
Хара Гобинды Хораны
предложил
способ амплификации ДНК с помощью пары коротких одноцепочечных молекул ДНК — синтетических праймеров
практического применения
в то время эта идея не нашла
Хара Гобинды Хораны

его целью было создание метода, который бы позволил амплифицировать ДНК в ходе многократных последовательных удвоений исходной молекулы ДНК с помощью фермента ДНК-полимеразы
полимеразная цепная реакция (ПЦР) была изобретена
в 1983 году американским биохимиком
Кэри Муллисом

спустя 8 лет после этого
за изобретение метода ПЦР
К. Муллис получил Нобелевскую премию
первая публикация
по методу ПЦР появилась в ноябре 1985 года в журнале Science

ПЦР-диагностика включает:
I. пробоподготовку
забор исследуемого материала и
его транспортировку в лабораторию

I. пробоподготовку
экстракция ДНК (РНК) из исследуемого образца
экстракция (извлечении) ДНК
из биопрепаратов
и удаление или нейтрализация посторонних примесей для получения ДНК с чистотой, пригодной для постановки реакции амплификации

II. АМПЛИФИКАЦИЮ
специфических фрагментов ДНК
амплификатор Corbett
АМПЛИФИКАЦИЯ ДНК- это процесс, увеличивающий число копий какого-либо гена или последовательности ДНК
в исследуемом материале
(выше обычного уровня)
in vitro
амплификация - лат. amplificatio - увеличение, распространение

II. АМПЛИФИКАЦИЮ
специфических фрагментов ДНК
а) денатурацию - исходная смесь нагревается до 94°С,
что обеспечивает расхождение нити ДНК
ПРОЦЕСС АМПЛИФИКАЦИИ включает:

в) отжиг – этап при котором температура исходной реакционной смеси снижается до 52 – 60°С и происходит комплементарное связывание праймеров с нитями матричной ДНК
праймеры – это искусственно синтезированные короткие однонитевые ДНК (20 – 30 нуклеотидов), выполняющие функцию «затравок» при ферментативном синтезе ДНК
при ПЦР используют 2 праймера, которые комплементарны
3'-концевым последовательностям амплифицируемого участка
на обеих нитях ДНК-матицы соответственно
расстояние между праймерами определяет длину
синтезируемых фрагментов ДНК

с) синтез новой цепи ДНК - полимеризация
это процесс в ходе которой
Taq-полимераза катализирует удлинение праймеров (с 3'-конца), что обеспечивает синтез новых цепей ДНК
температура реакционной смеси для проявления
оптимальной активности Taq-полимеразы соответствует 72°С
Taq-полимераза - термостабильная ДНК-полимераза, катализирующая реакцию полимеризации ДНК
Taq-полимераза должна сохранять активность при высокой температуре длительное время, поэтому используют ферменты, выделенные из термофилов

процеесс амплификации многократно повторяется в приборе – амплификаторе (термоциклере), что позволяет получить огромное количество копий нужного фрагмента ДНК
анализируемый участок ДНК амплифицируется более чем в миллион раз в результате проведения
20 циклов ПЦР

III. детекция продуктов амплификации
амплифицированный фрагмент выявляют в процессе электрофореза в 1,6 % агарозном геле

22.12.12

достоинства метода ПЦР:
среди методов диагностики инфекционных возбудителей ПЦР обладает наиболее высокими показателями чувствительности и специфичности (для Ампли-Сенс ПЦР-систем – 1000 микроор-мов/1 мл)
возможность использования разнообразного клинического материала
возможность одновременного выявления нескольких микроорганизмов в одной биологической пробе, в отличие от бактериологических методов, где для разных возбудителей используются разные способы культивирования;

22.12.12
повышенная стабильность при транспортировке, т.к. нет необходимости сохранять возбудителя в живом виде скорость проведения анализа (иногда < 24 ч.)
точное определение этиологии инфекции
определение количества возбудителя, это особенно актуально для факультативных патогенов, которые вызывают патологию только при определенных условиях
проведение контроля за течением инфекционного процесса

метод ПЦР, как и любой другой тест молекулярной диагностики, во многом зависит от правильности забора и транспортировки исследуемого материала

ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ (ПЦР)
Состав диагностического набора:
1. Праймеры
2. ДНК-зависимая ДНК-полимераза ( Таg-полимераза )
3. Нуклеотиды
4. Буферные растворы
« + »
1. Универсальность
2. Чувствительность
3. Высокая (100%) специфичность
5. Минимальный объем пробы для анализа
6. Возможность одновременного исследования
нескольких возбудителей заболеваний
7. Получение документального ответа в виде
фотографий и внесение результатов диагностики
на компьютер
4. Быстрота получения результата

Сфера применения ПЦР
Диагностика большого спектра частной патологии. Наиболее часто используется в практике для диагностики вирусного гепатита, герпетической, хламидиозной и микоплазменной инфекции, туберкулеза, сальмонеллеза, сифилиса, цитомегаловируса, ВИЧ.
Метод широко применяется в диагностике онкологических заболеваний: высокая чувствительность метода позволяет определять аномальную ДНК в ничтожно малых количествах (10-15-10-18 степени), что означает выявление неопластических клеток на доклинической стадии опухолевого процесса.
ПЦР применяется для пренатальной диагностики многих моногенных наследственных заболеваний, таких как гемофилия А и В, миодистрофия Дюшена-Беккера (набор DMD-CA ), агаммаглобулинемию, муковисцидоз (набор CF-8), фенилкетонурию (набор PCU-VNTR ), болезнь Коновалова-Вильсона и дефицит альфа-1-антитрипсина и других.
В судебно-медицинской практике метод ПЦР используется для определения отцовства, идентификации личности неопознанных трупов, доказательства причастности какого либо лица к совершению преступления
Очень перспективным направлением является использование ПЦР для определения патогенов в пищевых продуктах и абиотических средах (предметы обихода, жилище, одежда и т.п.). Метод используется в биотехнологии для определения трансгенных организмов.
Современная трансплантационная хирургия невозможна без использования метода ПЦР, который гарантированно показывает степень тождественности гомотрансплантатов.

Ни один из современных методов не обеспечивает 100 % выявления возбудителя инфекции
Целесообразным является :
использование не менее 2-х методов диагностики;
нередко требуется проведение повторных исследований
Задача врача заключается в правильном
выборе метода исследования и грамотной оценке его результатов !!!!