Люминесцентная (флуоресцентная) микроскопия презентация

ЛЮМИНЕСЦЕНТНАЯ МИКРОСКОПИЯ — метод микроскопии, позволяющий наблюдать первичную или вторичную люминесценцию микроорганизмов, клеток, тканей или отдельных структур, входящих в их состав

Отличия от светового микроскопа:
Мощный источник света в осветителе (ртутно-кварцевая лампа, галогенная кварцевая лампа);
Система светофильтров:
Возбуждающие светофильтры,
Теплозащитные светофильтры,
«Запирающие» светофильтры.

Горизонтальные линии — энергетические уровни электронов: S0 — основное, невозбужденное состояние; S1 — синглетное возбужденное состояние; 0 — 3 — квантованные подуровни; Т1, Т2 — квантованные уровни триплетного возбужденного состояния. Стрелками показаны переходы электронов в разные энергетические состояния
Диаграмма Яблонского.

Спектры флуоресценции Lyso SensorTMYellow/Blue при рН 3 и 9. При изменении кислотности среды меняются и максимум флуоресценции, и общая форма спектра.
Спектры поглощения (пунктир) и флуоресценции (сплошные линии) флуоресцеина и вещества с коммерческим названием Lyso TrackerTM Blue
Спектры поглощения и флуоресценции

Количественно определяется как отношение числа высвеченных фотонов к числу поглощенных. Чем больше квантовый выход, тем больше интенсивность свечения флуорофора.
Квантовый выход флуоресценции

Время жизни флуоресценции
Это величина порядка наносекунд для большинства флюорофоров. Она показывает усреднённое время существования молекулы в возбуждённом состоянии. Если построить график затухания флуоресценции во времени, он будет иметь вид экспоненциальной кривой. В простейшем случае падение будет моноэкспоненцальным, то есть будет иметь вид прямой в логарифмических координатах.

Анизотропия флуоресценции
Показывает, насколько свободно вращается молекула за время существования возбуждённого состояния. Свободные флюорофоры в жидких растворителях при нормальных условиях вращаются быстро, что вызывает полную деполяризацию. Если флюорофор связан с большой биомолекулой, например с белковой глобулой, такой комплекс вращается в пространстве медленнее, что приводит к ненулевым значениям анизотропии.

Тушение флуоресценции
F0/F - отношение начальной флуоресценции к флуоресценции в присутствии гасителя

Фёрстеровский резонансный перенос энергии (ФРПЭ)
Важным является что ФРПЭ происходит на расстояниях, соизмеримых с размерами биологических объектов, таких как белковые глобулы или мембраны клеток. При этом относительная эффективность переноса энергии обратно зависит от расстояния между ФРПЭ-партнёрами.

Органические флуорофоры

Трёхмерная структура молекулы зелёного флуоресцентного белка и структурная формула его флуорофора

Неорганические флуорофоры
Относительные размеры флуоресцентных репортеров. Для сравнения показан белок иммуноглобулин G (Ig G)

Методы флуоресцентной окраски клеток.
Низкомолекулярные органические флуоресцентные красители для клеточных органелл (Нил красный – мембраны, липосомы, цвет флуоресценции красный; Hoechst 33342 – ядерная ДНК, цвет - синий).
Иммунофлуоресцентная покраска. Этот метод базируется на использовании антител.
Автофлуоресцентные белки. Созданные на базе зелёного флуоресцентного белка и его аналогов, являются незаменимыми флуоресцентными маркерами клеточной и молекулярной биологии.