Молекулярно-цитогенетическая диагностика острых лейкозов презентация

Хромосомные нарушения
ключевая роль в патогенезе опухолей
критерии для классификации гематологических опухолей
цитогенетические маркеры опухолей
цитогенетические факторы прогноза
стратификация больных к терапии
«прицельня терапия» - коррекция имеющихся нарушений на генетическом или биохимическом уровне
оценка эффективности терапии и контроль минимальной резидуальной болезни

Материал для исследования
Клетки:
костного мозга
крови
лимфоузла
селезенки
любой опухолевой ткани

An International System for Human Cytogenetic Nomenclature
Денверская классификация хромосом, 1960 г. - первая Международная система цитогенетической номенклатуры хромосом человека, обеспечившая международную стандартизацию исследований хромосом еще на начальных этапах становления цитогенетики человека.
7 групп
на основании размеров хромосом и положения центромеры

дифференциальная окраска хромосом
(chromosome banding)
позволяет выявлять закономерно расположенные и закрепленные наследственно участки плотной конденсации вещества хромосом и, на основе их расположения, идентифицировать хромосомы, не различающиеся по признакам, видимым без такой окраски.
1968 г. - Torbjörn Caspersson
Q-окраска (Quinacrine – акрихин)

1971 г. - Marina Seabright
G-окраска (Giemsa – Гимза)
Парижская классификация хромосом, 1971

Хромосомы человека
Метафаза Кариотип: 46,XY

Стандартное цитогенетическое
исследование и FISH
44,XX,der(1)t(1;3)(q31;q10),der(8)t(3;8)(q10;q21),
t(11;14)(q13;q32),add(12)(p13),-13,add(16)(p13),-17
суспензия опухолевых клеток
отпечаток опухоли
парафиновый блок
мазок костного мозга

Стандартное цитогенетическое исследование
культивирование клеток
17-24 ч
прямая проба
задержка митоза (колхицин/колцемид)
обработка гипотоническим раствором KCl
фиксация (метанол+ледяная уксусная кислота)
приготовление препаратов и окраска хромосом
кариотипирование

Количественные изменения кариотипа
трисомия
дополнительная хромосома
в двух и более метафазах –
гипердиплоидия моносомия
отсутствие хромосомы
в трех и более метафазах –
гиподиплоидия

реципрокная транслокация -
обмен участками хромосом
Структурные хромосомные аберрации
9 22 t(9;22)(q34;q11)

Инверсии
парацентрическая инверсия
поворот участка хромосомы
на 1800 вокруг центромеры
перицентрическая инверсия
поворот участка хромосомы
на 1800 внутри плеча
3 inv(3)(q21q26)
16 inv(16)(p13q22)

Инсерция
перемещение хромосомного сегмента в новое
положение внутри той же или другой хромосомы
1 8 ins(1;8)(q21;q22q24)

Делеция
потеря участка хромосомы
5 del(5)(q13q33)

Дупликация
dup(1)(q21q32)

Изохромосома
7 i(7)(q10)

Дицентрическая хромосома
dic

Кольцевая хромосома
r

Дополнительный хромосомный материал
неизвестного происхождения
add

73~77<4n>XX,t(Y;13)(q10;q10)x2,t(1;5)(p22;q14~15),-2x2,add(2)(q37)or t(1;2)(q31;q37),-3,-4,
add(4)(p16)x2,+add(5) (p22;q14~15)or t(1;5)(p22;q14~15),add(6)(p23~25),add(7)(q36),-9,-10x2,
del(11)(p12),-12,add(12)(?q23),del(13)(q22),-14,add(14)(q32),-15,-17x2,add(20)(p13),-21,add(22)(p11),
+add(22)(p11)or t(9;22)(q10;q10),+3 mar
Дериват хромосомы
der

45,XX,add(2)(p21),-3,der(3)inv(3)(q21q26),-5,del(5)(q13q33),del(6)(q13),-7,-8,
del(12)(p12),der(12)del(12)(q22),+5mar[4]/ 45,XX,add(2)(p21) ,del(3)( q26),der(4),
-5,del(6)(q13),-7,-8,-11,der(11),del(12)(p12),der(12)del(12)(q22),-15,-18,+5mar[6]
Маркерная хромосома
mar

Комплексные (множественные) перестройки
три и более аберрации

Кариотип: 46,XY [20]
Кариотип: 46,XX,t(15;17)(q22;q21) [20]
Кариотип: 47,XY,t(9;22)(q34;q11),+8 [16]/46,XY [4]
Кариотип: 46,XX,t(9;22)(q34;q11) [6]/47,idem,+8 [14]
Кариотип: 46,XX,t(9;22)(q34;q11) [12]/46,XX,del(13)(q14) [15]
Кариотип: 43-47,XX,add(2)(p21),inv(3)(q21q26),der(4),-5,del(6)(q13),-7,-8,der(11),
del(12)(p?12),-15,-18,+5mar [cp10]
An International System for Human Cytogenetic Nomenclature, 2013

Fluorescence in situ hybridization (FISH)
окраска флюорохромами участков комплементарной ДНК
прицельный поиск определенных хромосомных нарушений
интерфазная и метафазная

Флюоресцентная гибридизация in situ (FISH)

Центромерные пробы
Моносомия
Трисомия

t(14;18)(q32;q21)
t(18q21)/BCL2
Пробы для выявления транслокаций
Dual Fusion Translocation Probe
Break Apart Probe

Пробы для выявления инверсий/транслокаций

Пробы для выявления делеций

Пробы для выявления делеций и моносомий
делеция 17р13/р53
моносомия 17

Пробы к целым хромосомам
WCP1

Мulticolor FISH (M-FISH)
www.metasystems-international.com
флюорохромы:
FITC
Spectrum Orange ™
TexasRed ® DEAC
Cy5 ®

раздельная цифровая регистрация сигнала всех используемых флюорохромов при последовательной смене набора фильтров
специальное ПО переводит информацию об уровне сигналов флюорохромов в каждой точке изображения в псевдоцвета
не позволяет выявлять внутрихромосомные аномалии и перестройки между гомологичными хромосомами

Multicolor BAND (M-BAND)
www.metasystems-international.com
многоцветная идентификация хромосом
высокого разрешения
район специфичные ДНК пробы помечены различными флюорохромами или их комбинациями
ПО проводит сравнительный анализ уровня свечения различных флюорохромов

An International System for Human Cytogenetic Nomenclature, 2013
nuc ish: (D7Z1,D7S522)x2 [200]
nuc ish: (D7Z1x2,D7S522x1) [62/200]
nuc ish: (ABL,BCR)x2 [200]
nuc ish: (ABL,BCR)x3(ABL con BCRx2) [198/200]
nuc ish: (MYCx2)[200]
nuc ish: (MYCx2) (5’MYC sep 3’MYCx1)[180/200]

Филадельфийская хромосома
(1960 г., Peter C. Nowell and
David A. Hungerford)
сплошная окраска хромосом
Хронический миелолейкоз - первое гематологическое заболевание, при котором был обнаружен хромосомный маркер и цитогенетическая клональность

(1973 г., Janet Rowley)
______________________________
9 22
t(9;22)(q34;q11)
Lore Zech

Миелодиспластический синдром
Хромосомные аберрации - ~50% случаев

WHO Classification of Tumours
of Haematopoietic and Lymphoid Tissues, 2008

del(5)(q13q33)
10%
5q- синдром:
рефрактерная макроцитарная анемия;
лейкоциты - N или умеренно ?;
тромбоциты - N или ?;
гипоплазия и дисплазия эритроидного (часто мегалобластоидный
характер кроветворения) и мегакариоцитарного ростков
болеют преимущественно женщины (65-70 лет)
del(5q) единственная в кариотипе
благоприятный прогноз
терапия – леналидомид

7
del(7)(q22)
10%
чаще в составе комплексного кариотипа
характерна для вторичного МДС
риск трансформации в ОМЛ

3
inv(3)(q21q26)
или t(3;3)(q21;q26)
2%
EVI1/3q26
N или уровень Тр
гиперклеточный к/м
выраженная трехростковая дисплазия,
особенно мегакариоциоцитарного
ростка
высокий риск трансформации в ОМЛ

трисомия 8
10%
20
del(20)(q11)
единственное нарушение в кариотипе –
дисплазия эритроидного и
мегакариоцитарного ростков
потеря хромосомы Y
5%
5-8%
может быть возрастная

Прогностические группы
(IPSS prognostic index, 1997; WHO, 2008)

IPSS-R

Острые миелоидные лейкозы
WHO Classification of Tumours
of Haematopoietic and Lymphoid Tissues, 2008
Хромосомные нарушения –
80-90% случаев ОМЛ

t(15;17)(q22;q21)
Острый промиелоцитарный лейкоз
t(15;17)(q22;q21)
5-8% ОМЛ
химерный ген PML-RARα
прицельная терапия – (АТРА) + ХТ

вариантные:
t(11;17)(q23;q21) - ZBTB16;
t(11;17)(q13;q21) - NUMA1;
t(5;17)(q32;q21) - NPM1;
t(17;17)(q11;q21) - STATSB

5% ОМЛ
10% M2 FAB
химерный ген RUNX1-RUNX1T1
t(8;21)(q22;q22)
t(8;21)(q22;q22)

inv(16)(p13q22)
16
5-8% ОМЛ
чаще у молодых больных
M4эо FAB
химерный ген CBFB-MYH11
в 40% случаев - вторичные
хромосомные аберрации: +22, +8 (10 -15% каждая),
del(7q) и +21 (5%)
inv(16)(p13q22) или t(16;16)(p13;q22)

t(15;17)(q22;q21)
t(8;21)(q22;q22)
inv(16)(p13q22) или t(16;16)(p13;q22)
Высокоспецифичны для ОМЛ
Диагноз ОМЛ вне зависимости от количества БК

9
11
t(9;11)(p22;q23)
2% ОМЛ взрослых
9-12% - дети
M5 FAB
химерный ген MLLT3(AF9)-MLL
t(v;11q23)/MLL
>80 хромосомных партнеров
ABBOTT
t(v;11q23)/MLL

вариантные транслокации:
t(4;11)(q21;q23) - MLLT2(AF4)
t(11;19)(q23;p13.3) - MLLT1(ENL)
t(10;11)(p12q23) - MLLT1O (AF1O)
t(6;11)(q27;q23) - MLLT4 (AF6)
t(11;19)(q23;p13.1) - ELL

6
9
t(6;9)(p23;q34)
химерный ген DEK-NUP214
1-2% ОМЛ взрослых и детей
базофилия в к/м и п/к – 50% случаев
трехростковая дисплазия
t(6;9)(p23;q34)

inv(3)(q21q26) или t(3;3)(q21;q26)
inv(3)(q21q26)
RPN/EVI1
de novo или из МДС
N или уровень Тр
гиперклеточный к/м
выраженная трехростковая дисплазия,
особенно мегакариоциоцитарного
ростка (атипичные мегакариоциты)

t(1;22)(p13;q13)
RBM15-MKL1
de novo
мегакариобластный лейкоз (М7)
дети до 3х лет
органомегалия

другие
del5q/-5
del7q/-7
+8
del9p21
del11q23
del13q
del17p
-Y
t(9;22)(q34;q11)

Цитогенетические группы прогноза ОМЛ

Молекулярно-генетические маркеры прогноза ОМЛ
FLT3/13q12.2
внутренние тандемные дупликации (ITD)
точечные мутации в тирозинкиназном домене (TKD) ?
NPM1/5q35
de novo М4 или М5 ОМЛ
у пожилых больных с нормальным кариотипом
СЕВРА/ 19q13.1
de novo М1 или М2 ОМЛ, редко М4 или М5

Метод основан на разделении меченных флюоресцентным
красителем ПЦР-продуктов в капиллярах, заполненных гелем.
ПЦР с праймерами, меченными флюоресцентной меткой.
При капиллярном электрофорезе денатурированные
ПЦР-продукты разделяются по длине с точностью до одного
нуклеотида, вне зависимости от нуклеотидного состава.
Для исследования используется автоматический анализатор
нуклеиновых кислот.
Метод фрагментного анализа
(Лаборатория молекулярной гематологии,
зав. лаб. д.б.н. Судариков А.Б.)

Döhner H, et al. Blood. 2010 Jan 21;115(3):453-74.
Цитогенетические и молекулярно-генетические
факторы прогноза ОМЛ

Острые В-лимфобластные лейкозы
WHO Classification of Tumours
of Haematopoietic and Lymphoid Tissues, 2008

Стандартное цитогенетическое исследование + дополнительные перестройки
взрослые – 25%
дети – 3-5%
химерный ген BCR/ABL
t(9;22)(q34;q11)

5-15%
самая частая t(4;11)(q21;q23)
химерный ген AF4-MLL
t(v;11q23)/MLL
>80 хромосомных партнеров
для 35 – гены-партнеры не охарактеризованы
на молекулярном уровне

дети – 25%
взрослые – очень редко
химерный ген ETV6-RUNX1
не выявляется при стандартном
цитогенетическом исследовании
t(12;21)(р12;q22)
ABBOTT

t(1;19)(q23;p13)
дети – 6%
взрослые – очень редко
химерный ген TCF3-PBX1
сбалансированная форма
несбалансированная форма

iAMP21
Le Coniat et al., 2001
Vysis LSI ETV6/RUNX1 ES DC

Количественные изменения кариотипа
Гипердиплоидия
50-67 хромосом (большая гипердиплоидия)
дети - 20-30%
взрослые – редко
Гиподиплоидия
<45 хромосом – 5%

Прогноз
Обязательно выполнение FISH для выявления
t(9;22)(q34;q11)
t(11q23)/MLL

Острые Т-лимфобластные лейкозы
Хромосомные нарушения – 50-70% случаев
транслокации TCR a/d - 14q11, TCR β – 7q35 и TCR γ - 7p14- 15
с многочисленными хромосомными партнерами:
HOX 11( TLX1) - 10q24 - 30% случаев
HOX11L2 (TLX3) - 5q35 - 10-15%
С-MYC – 8q24
TAL1 - 1p32
RBTN1 - 11p15
RBTN2 - 11p13
LYL1 - 19p1 3
и др.

Контроль минимальной резидуальной болезни
по выявленному до лечения цитогенетическому
маркеру (острые лейкозы)
Исследование химеризма после разнополой
трансплантации ПСКК
XX/XY

42-44,XY,del(2)(p21), -5,-7,del(12)(p12),-12,-13,-15,-16,-17,-19, 42-44,XY, t(5;15;17;22),del 13,del 15, t(7;13), t(16;17;19;21)
+6-7mar [cp30]