Молекулярно-генетическая диагностика колоректального рака презентация

Сокращения
РЭА - раковоэмбриональный антиген/
CEA - carcinoembryonic antigen
СА 19-9, СА 242 - карбогидратные антигены
АФП - α-фетопротеин
MSI – микросателлитная нестабильность
MSS – микросателлитная стабильность

Давыдов М. И., Аксель Е. М. Статистика злокачественных новообразований в России и странах СНГ в 2009 г //Вестник РОНц им. НН Блохина РАМН. – 2011. – Т. 22. – №. 3. – С. 85.
За последние 20 лет рак толстой кишки переместился в структуре онкологической заболеваемости населения Российской Федерации на третье место. Тревожным является тот факт, что на 100 вновь выявленных больных КРР приходится более 70 умерших, из них на 1-ом году с момента установления диагноза – около 40%.

Cancer Statistics, 2009
Cancer Statistics, 2009, Volume: 59, Issue: 4, Pages: 225-249, First published: 09 July 2009, DOI: (10.3322/caac.20006)

CA CANCER J CLIN 2009;59:225-249
https://doi.org/10.3322/caac.20006

www.seer.cancer.gov

Этиология КРР
Большинство случаев является спорадическими, лишь 5 - 10% составляют наследственные раки, предрасположенность к которым передается по аутосомно-доминантному типу.
Предрасполагающие факторы:
Воспалительные заболевания кишечника (язвенный колит, болезнь Крона)
Полипы
Факторы риска:
Возраст после 50 лет риск развития КРР удваивается в каждую последующую декаду жизни и достигает максимума в 60-75 лет
Особенности питания, «западный» стиль жизни
Ранее перенесенный КРР, рак женских гениталий или молочной железы, а также наличие в анамнезе КРР у кровных родственников

Семейный аденоматозный полипоз (САП)
Популяционная частота составляет 1:8000 новорожденных
Ген предрасположенности APC (Adenomatous Polyposis Coli) на участке 5q21 содержит 15 экзонов (8535 нуклеотидных пар) и кодирует белок с молекулярной массой 310 кД, состоящий из 2843 аминокислотных остатков.
Функциональная значимость мутаций АРС связана с его ключевой ролью в регуляции клеточного деления эпителия толстой кишки и других тканей.
Риск развития САП и КРР у носителей мутаций гена АРС близок к 100%.
Опухоли других локализаций (желудка, тела матки, щитовидной железы, молочной железы, центральной нервной системы, а также первично-множественные злокачественные новообразования) могут возникать у 75% пациентов-носителей.
В семьях, где САП не сцеплен с локусом 5q21, геномный скрининг позволил идентифицировать на хромосоме 1р32-34 ген MYH (MutY Homologue), ассоциированный с аутосомно-рецессивной формой семейного полипоза.

Диагностика САП
Подозрение на семейный аденоматоз – тестирование на мутацию гена АРС:
А) при наличии у пациента более 20 полипов кишечника
В) при наличии у пациента родственника первой линии с установленным диагнозом семейного аденоматоза
Подозрение на наличие аттенуированной формы семейного аденоматоза, MYH–ассоциированный полипоз – тестирование на мутацию MYH – пациенты, у которых выявлено более 20 полипов толстой кишки, но с отрицательным анализом на мутацию АРС:
А) пациенты, у которых в семье прослеживается рецессивное наследование семейного аденоматоза;
Б) пациенты, у которых полипы выявляются в более позднем возрасте (34-44 лет).

Наследственный неполипозный колоректальный рак (ННКРР, синдром Линча)
Популяционная частота составляет 1:500 - 1:1000 [Rahner N. et al, 2010]
В основе патогенеза ННКРР - нарушение системы репарации неспаренных оснований ДНК (mismatch-репарации).
В опухолевых клетках дефект репарации проявляется в виде нестабильности длины микросателлитных повторов (MSI).
Согласно данным литературы, тест на MSI оказывается положительным более чем в 90 % случаев при ННКРР [Muller A. et al., 2004]
Гены, наличие герминальных мутаций в которых приводит к развитию синдрома Линча: 6 генов mismatch repair system MMR – MLH1, MSH2, MSH3, MSH6 (GTBP), MLH3, PMS2 и ЕXOl
Около 90% мутаций - в генах MLH1 и MSH2

Амстердамские критерии, критерии Бетезды
[Vasen H.F. et al., 1999; Umar A. Et al., 2004]:
1. Молодой возраст возникновения заболевания (до 50 лет)
2. Наличие трёх или более родственников с HNPCC- ассоциированными опухолями (рак толстой кишки, рак эндометрия, рак тонкого кишечника, желудка, яичников, уретры, почечной лоханки, синдром Тюрко или синдром Мюирр-Торре)
3. Заболевание должно встречаться более, чем в одном поколении, не меньше чем один из заболевших, должен быть родственником первой степени родства по отношению к остальным двум.
Первично- множественный характер злокачественных новообразований
Семейный аденоматозный полипоз должен быть исключен.
Для пациентов с наличием клинических критериев HNPCC-тест на MSI,
для MSI+ последующее ДНК-секвенирование кодирующей последовательности генов MMR с целью выявления в них герминогенных мутаций.
Только в случае выявления зародышевой мутации может быть поставлен диагноз синдрома Линча.

Микросателлитная нестабильность – состояние особой склонности ДНК клетки к развитию стойких изменений в последовательности нуклеотидов входящих в её структуру.
Микросателлиты - короткие последовательности в ДНК из 1-5 оснований, повторяющиеся до нескольких десятков раз. Микросателлиты встречаются и в норме. При нестабильности их число увеличивается, что и может быть выявлено.
Лабораторный тест на микросаттелитную нестабильность (выделение тотальной ДНК из парафиновых срезов, ПЦР) с использованием панели мононуклеотидных маркеров ВАТ25, ВАТ26 и ВАТ40 и последующим сравнением с нормальной тканью (чаще кровью)

Семейство генов RAS (Retrovirus Associated DNA Sequences: KRAS, HRAS, NRAS )
-ВRAF- MEK-ERK-МАРК
(Постоянная активация сигнального каскада рецептора эпидермального фактора роста (EGFR) как одной из ведущих причин опухолевой трансформации и прогрессии)

Когда же еще необходимо тестирование молекулярных биомаркеров?
*По рекомендациям American Society for Clinical Pathology, College of American Pathologists, Association for Molecular Pathology, and ASCO[7] and ESMO 2016
Пациенты с КРР, рассматривающиеся для терапии антиэпидермальными факторами роста (EGFR) цетуксимабом и панитумумабом, и пациенты с диагностироваными или заподозреными отдаленными метастазами аденокарциномы должны пройти мутационное тестирование RAS (экзоны 2–4 генов KRAS и NRAS), т.к. наличие мутаций RAS является негативным прогностическим биомаркером для ответа на терапию антителом EGFR для mCRC.
Мутационный анализ положения BRAF p.V600 следует проводить в ткани КРР у отдельных пациентов для прогностической стратификации.
Тестирование дигидропиримидиндегидрогеназы (DPD) перед введением фторурацила (5-FU) остается вариантом, но обычно не рекомендуется; Однако это следует сделать до повторного введения 5-ФУ у пациентов, которые испытали тяжелую токсичность 5-ФУ.
Тестирование MSI в условиях мКРР может предоставить полезную информацию для генетического консультирования и имеет сильную прогностическую ценность для использования ингибиторов контрольных точек (например, пембролизумаба)
Клиницистам следует назначить тестирование, чтобы идентифицировать пациентов с MMR высоким риском синдрома Линча и / или прогностической стратификации.

The guidelines ESMO не рекомендуют следующие новые биомаркеры для рутинного ведения пациентов вне рамок клинических испытаний:
Мутации в PIK3CA, экзон 20
Потеря PTEN от IHC
Уровни лигандов EGFR амфирегулина, эпирегулина и TGF-α
Уровни экспрессии белка EGFR
Амплификация EGFR и число копий, а также мутации эктодомена EGFR
HER2-амплификация или HER2-активирующие мутации
Сверхэкспрессия рецепторов HER3 и MET

сывороточные онкомаркеры

Клинические рекомендации МЗ РФ 2018г
Рак ободочной кишки и ректосигмоидного отдела
Профессиональные ассоциации: Ассоциация онкологов России Российское общество клинической онкологии
2.3 Лабораторная диагностика онкомаркеры РЭА, СА 19.9
Уровень убедительности рекомендаций - С (уровень достоверности доказательств - IV)
5. Профилактика онкомаркеры РЭА, СА 19.9 каждые 3 месяца первые 2 года и далее каждые 6 мес. в последующие 3 года.
Уровень убедительности рекомендаций - A (уровень достоверности доказательств - Ia)
Содержание сывороточных маркеров не имеет самостоятельного значения в диагностике и оценке степени распространения болезни и в большей степени содержит информацию о прогностических характеристиках опухоли; этот метод может быть использован при динамическом наблюдении за больными, а также для оценки эффективности терапии.

Раково-эмбриональный антиген
(РЭА/CEA - Carcinoembryonic antigen)
Онкофетальный белок, обнаруживается в эпителиальных клетках пищеварительного тракта и бронхов.
У взрослых людей продуцируется в очень ограниченном количестве эпителиальными клетками бронхов, молочной железы и кишечного тракта.
В минимальных количествах РЭА обнаруживается в крови, плевральном экссудате, асцитической жидкости и спинномозговой жидкости.
Степень повышения РЭА коррелирует не столько с массой опухоли, сколько со степенью дифференцировки опухолевых клеток, и больные с низкодифференцированными опухолями могут иметь нормальный уровень этого маркера.
Значения нормы: 0–5 нг/мл.
Пограничные значения: 5–8 нг/мл.
Патологические значения: >8 нг/мл.

СА 19-9 (карбогидратный антиген)
Распространенность этого маркера тесно связана с группами крови.
При редко встречающейся группе Lewis (А/В) он не вырабатывается
(из-за дефицита фермента фукозилтрансферазы, необходимого для синтеза белка СА 19-9 и антигена Льюиса).
У взрослых вырабатывается в очень небольшом количестве эпителиальными клетками бронхов и пищеварительного тракта.
В минимальных концентрациях присутствует в крови, плевральном экссудате, асцитической и спинномозговой жидкости. При КРР определяется в комбинации с РЭА.
Выведение СА 19-9 из организма происходит через желчные пути, поэтому любое затруднение оттока желчи сопровождается повышением его уровня. В этих случаях для уточнения диагноза используются показатели гаммаглутаминтрансфераза и щелочная фосфатаза.
Значения нормы : 0–30 МЕ/мл
Пограничные значения: 30–40 МЕ/мл
Патологические значения: 40 МЕ/мл и выше

АФП (альфа-фетопротеин)
Определение АФП имеет второстепенное значение.
АФП вырабатывается желточным мешком, а позже и печенью плода.
При достижении двухлетнего возраста уровень АФП составляет 5 мг/л и сохраняется на этом уровне у взрослых здоровых людей.
Повышается при герминогенных опухолях.
Пограничные значения: 5–10 МЕ/мл
Патологические значения: 10 МЕ/мл и выше

Tumor M2-PK
(опухолевая М2-пируват-киназа)
Высокоспецифичный опухолевой белок, не обладает органоспецифичностью и может быть маркером выбора для диагностики разных опухолей.
Выявляет специфический для опухолей метаболический статус вне зависимости от их локализации.
Является маркером степени агрессивности злокачественной опухоли.
В отличие от других онкомаркеров, используемых в клинической практике, является не накопительным, а метаболическим маркером, и наиболее рано и в достаточном для определения количестве поступает в кровоток.
Определение содержания Tu M2-PK дает возможность ранней диагностики опухолей, возникновения метастазов или рецидивов опухоли.
Пограничные значения: 15–20 Ед/мл
Патологические значения: 20 Ед/мл и выше

СА 242
Эпитоп антигена СА 242 представляет собой сиаловый углевод, который располагается на гликопротеине типа муцина в карциномах многих органов.
Для диагностики и наблюдения за ходом болезни при раке ЖКТ исследуется в комбинации с РЭА.
Значения нормы: 0–30 МЕ/мл (медиана=6,4)

Выводы
Несмотря на то, что развитие колоректального рака в большинстве случаев носит спорадический характер, а на долю наследственного КРР приходится от 5 до 15 % всех новообразований толстой кишки, данная проблема является особенно актуальной.
Т.к. пациенты с синдромом Линча имеют более благоприятный прогноз, небольшую частоту метастазирования, свои особенности чувствительности к различным группам химиопрепаратов, что так же важно и для других наследственных патологий. Поэтому ранняя диагностика у данной категории пациентов позволяет надеется на полное излечение от заболевания и дает возможность для стратификации риска развития КРР у родственников .
Что касается сывороточных онкомаркеров, сегодня они могут использоваться как критерий опухолевого ответа на лечение, а также для оценки прогноза. Однако исследователи надеются, что в скором времени они будут использовать онкомаркеры и для скрининговых тестов, что может помочь раннему обнаружению опухолей в бессимптомном периоде.