Нестабильность генома неопластических клеток. Лекция 5 презентация

Нестабильность генома
(мутации и эпигенетические изменения)
Нечувствительность к
рост-ингибирующим сигналам
(приобретение бессмертия и др.)
Постоянная инициация митотических циклов
Интенсивное и
неограниченное во времени деление клеток
Подавление
программируемой
гибели клеток
(апоптоза, аутофагии и др.)

Онкогенез – многоступенчатый процесс
отбора клеток с рядом генетических изменений,
определяющих свойства злокачественной клетки

Легко обнаруживаемые проявления нестабильности
генома опухолевых клеток:
(SKY – многоцветное спектральное кариотипирование)
Множественные изменения кариотипа
Bat25
D17S250
Нестабильность
микросателлитной ДНК
Клетка рака молочной железы
ДНК из опухоли (Т) и нормальной ткани (N) пациента
с раком толстой кишки

В первых исследованиях геномов и транскриптомов опухолевых тканей (Wood еt al, Science, 2007; Jones et al., Parsons et al., Science, 2008) при анализе последовательностей 23219 транскриптов (20261 белок-кодирующих генов), в каждой из опухолей (24 рака молочной железы, 11 раков ободочной кишки, 24 рака поджелудочной железы, 22 глиобластомы) было найдено 40-190 значимых мутаций (всего ~2000 мутированных генов), затрагивающих активность не менее 12 сигнальных путей.
(Jones et al., Science, 2008)

Многочисленные изменения геномов/транскриптомов
опухолевых клеток являются отражением их генетической нестабильности и клонального разнообразия формируемых ими новообразований
Yates LR, Campbell PJ. Evolution of the cancer genome. Nat Rev Genet. 2012, November, 13(11):795-806

Хромотрипсис
Одномоментный клеточный кризис, ведущий к образованию сложных комплексных хромосомных перестроек (10-100) в одной или нескольких хромосомах.
Наблюдается в 2-3% опухолей (остеосаркомы – до 33%) и при некоторых врожденных заболеваниях.
Возможные причины – γ-облучение, свободные радикалы, слипание/разрыв хромосом, формирование микроядер при нарушении митоза, незавершенный апоптоз и др.
Stephens P.J. et al., 2011. Cell. 144, 27–40;
Storchová Z, Kloosterman WP. Curr Opin Cell Biol. 2016;40:106-113
Rode A. et al, 2016, DOI: 10.1002/ijc.29888

Характерные для опухолевых клеток
изменения генома (активация онкогенов,
инактивация опухолевых супрессоров и др.)
Понижение
точности реп-
ликации ДНК
и сегрегации
хромосом
Возникновение и размножение
клеток с различными изменениями генома
Нарушения
систем
репарации
ДНК
Повышение
продукции
АФК и др.
эндогенных
мутагенов
Ослабление
чекпойнтов
клеточного
цикла
Ослабление
индукции апоптоза
Понижение
детоксикации
эндогенных
и экзогенных
мутагенов

Характерные для опухолевых клеток
изменения генома (активация онкогенов,
инактивация опухолевых супрессоров и др.)
Понижение
точности реп-
ликации ДНК
и сегрегации
хромосом
Возникновение модификаций ДНК
и изменений числа хромосом
Нарушения
систем
репарации
ДНК
Повышение
продукции
АФК и др.
эндогенных
мутагенов
Ослабление
чекпойнтов
клеточного
цикла
Понижение
детоксикации
эндогенных
и экзогенных
мутагенов

Мутагенные факторы:
Эндогенные – а) ошибки репликации ДНК и митоза;
б) внутриклеточные свободные радикалы (активные формы кислорода, азота и др.)
Экзогенные – солнечная иррадиация, химические мутагены
окружающей среды и т.д.

Нарушения экспрессии онкогенов и опухолевых супрессоров
увеличивают частоту возникновения генетических ошибок
Proofreading by polymerase δ
Гетерозиготные наследственные мутации в корректирующем (экзонуклеазном) домене полимераз δ и ε ассоциированы с множественными аденомами и ранними карциномами толстой кишки и раком эндометрия. Соматические мутации вызывают гипермутирующие, микросателлит-стабильные опухоли.
(Palles et al., Nature Genetics, 2013)

Нарушения экспрессии онкогенов и опухолевых супрессоров
увеличивают частоту возникновения генетических ошибок
Неправильная
сегрегация хромосом
Изменения числа центросом,
нарушения прикрепления
веретена к кинетохору и др.
p53, BRCA1, АРС
Понижение точности
репликации ДНК
Повышение экспрессии и
активности низкоточных
полимераз
Bcr/Abl
Ras
Вирусные
онкогены
(EBV, HCV)

Трехполюсный
митоз
Амплификация
центросом
Норма
p21Cip1
CycE/
Cdk2
Многократная
репликация
центросом
p53
p21Cip1
CycE/
Cdk2
Однократная
репликация
центросом
(конец G1/начало S)
BRCA1
p53
BRCA1
АPC, p53,
BRCA1 в
центросомах
Ras
Ras
Четырехполюсный
митоз
Три дочерние клетки
в цитокинезе

Анеуплоидия (~ 90% опухолей)

Эндогенные мутагенные факторы:
а) ошибки репликации ДНК и митоза;
б) внутриклеточные свободные радикалы
(активные формы кислорода, азота и др.)

Активные формы кислорода (АФК) образуются в ходе постепенного восстановления молекул кислорода, как побочные продукты ряда внутриклеточных процессов
Основные АФК:
перекись водорода – Н2О2 : двуэлектронное восстановление О2
: одноэлектронное восстановление О2

Эндогенные источники,
воспаление,
радиация,
хим. агенты
О2-
Н2О2
Н2О + О2
-ОН + ОН-
Повреждения
Cu+/Fe2+
супероксид-дисмутазы
(CuZnSOD,
MnSOD,
ECSOD)
каталаза,
перокси-редоксины I-VI,
тиоредоксин,
глютатион-пероксидазы
Метаболизм АФК

АФК – не только повреждающие, но
и важные сигнальные молекулы
Окисляя компоненты различных сигнальных путей (фосфатазы и др.), они регулируют деление клеток, их миграцию и другие физиологические реакции

АФК
Окисление
ДНК
Окисление
компонентов
сигнальных
путей
Массивные
повреждения
ДНК и др.
макромолекул
Сильное
повышение
Умеренное
повышение
Понижение
Избыточное
восстановление
компонентов
сигнальных
путей
Неблагоприятные последствия отклонений в уровне
Остановка
деления,
апоптоз
Мутагенез
Стимуляция
деления и
миграции
клеток
Замедление
деления и
миграции,
аномалии
митоза

Окисление оснований в ДНК

Умеренное повышение содержания активных
форм кислорода
Активация RAS,
МYC и др.
Инактивация р53
Инфекция HBV,
HCV и др.
Множественные механизмы
Мутагенез
Стимуляция деления
и миграции клеток
Изменение уровня АФК в опухолевых клетках

Активированные
онкогены RAS
Энзиматический синтез супероксидного радикала
Повышение содержания
активных форм кислорода
Подавление антиоксидантной защиты
PI3K-Rac-NADPH оксидаза
Окисление ДНК и мутагенез
Репрессия генов сестринов,
гипофункция пероксиредоксинов

Сигнальный путь Nrf2–Keap1
Sporn and Liby, 2012 Nat Rev Cancer; 12(8): doi:10.1038/nrc3278
Nrf2 – транскрипционный фактор, активирующий экспрессию генов антиоксидантной защиты

Oncogene-induced Nrf2 transcription promotes ROS detoxification and tumorigenesis
Perera and Bardeesy, Nature, 2011, 43-44
When antioxidants are bad
ROS are mutagenic and may thereby promote cancer.
Normally, ROS levels are tightly controlled by an inducible antioxidant program that responds to cellular stressors and is predominantly regulated by the transcription factor Nrf2 and its repressor protein Keap1. In contrast to the acute physiological regulation of Nrf2, in neoplasia there is evidence for increased basal activation of Nrf2. Indeed, somatic mutations that disrupt the Nrf2–Keap1 interaction to stabilize Nrf2 and increase the constitutive transcription of Nrf2 target genes were recently identified, indicating that enhanced ROS detoxification and additional Nrf2 functions may in fact be protumorigenic. Here, we investigated ROS metabolism in primary murine cells following the expression of endogenous oncogenic alleles of Kras, Braf and Myc, and found that ROS are actively suppressed by these oncogenes. K-RasG12D, B-RafV619E and MycERT2 each increased the transcription of Nrf2 to stably elevate the basal Nrf2 antioxidant program and thereby lower intracellular ROS and confer a more reduced intracellular environment. Oncogene-directed increased expression of Nrf2 is a new mechanism for the activation of the Nrf2 antioxidant program, and is evident in primary cells and tissues of mice expressing K-RasG12D and B-RafV619E, and in human pancreatic cancer. Furthermore, genetic targeting of the Nrf2 pathway impairs K-RasG12D-induced proliferation and tumorigenesis in vivo. Thus, the Nrf2 antioxidant and cellular detoxification program represents a previously unappreciated mediator of oncogenesis.
New work suggests that ROS might have a role in mitigating certain cancers – see DeNicola et al., Nature, 2011, 475:106-111
См. также Geismann et al., Onco Targets Ther., 7:1497-518, 2014

Контекст-зависимая роль Nrf2 в канцерогенезе
Sporn and Liby, 2012. Nat Rev Cancer; 12(8): doi:10.1038/nrc3278

Нарушения Nrf2–Keap1 сигнализации в опухолях

Повышение содержания NO
Активация RAS,
МYC и др.
Инактивация р53
Инфекция HBV,
HCV и др.
Увеличенный синтез iNOS
Нитрирование ДНК и мутагенез

Характерные для опухолевых клеток
изменения генома (активация онкогенов,
инактивация опухолевых супрессоров и др.)
Понижение
точности реп-
ликации ДНК
и сегрегации
хромосом
Возникновение модификаций ДНК
Нарушения
систем
репарации
ДНК
Повышение
продукции
АФК и др.
эндогенных
мутагенов
Ослабление
чекпойнтов
клеточного
цикла
Понижение
детоксикации
эндогенных
и экзогенных
мутагенов

Во многих опухолях понижена экспрессия глютатион-S-
трансферазы, детоксифицирующей реактивные соединения
путем переноса на них SH-группы глютатиона
Интраэпителиальная неоплазия простаты
(PIN), окраска анителами к GST-π
Снижение экспрессии GST-π
выявляется в 90% раков простаты

Характерные для опухолевых клеток
изменения генома (активация онкогенов,
инактивация опухолевых супрессоров и др.)
Возникновение различных модификаций ДНК
и/или изменений генома
Нарушения
систем
репарации
ДНК
Ослабление
чекпойнтов
клеточного
цикла
Нарушения
систем
репарации
ДНК
Появление клеток с нарушениями
структуры ДНК (мутациями)
Понижение
детоксикации
эндогенных
и экзогенных
мутагенов
Понижение
точности реп-
ликации ДНК
и сегрегации
хромосом
Повышение
продукции
АФК и др.
эндогенных
мутагенов

Повреждение ДНК
Белки-сенсоры
аномальных структур ДНК
Восстановление
структуры ДНК
Белки
репарационных
систем
Остановка
деления, апоптоз
Передатчики сигналов
(BRCA1, ATM/ATR и др.)
Chk1, Chk2,
р53 и др.
связывание белков,
фосфорилирование

Эксцизионная репарация ДНК

Репарация двуцепочечных разрывов ДНК
Гомологичная рекомбинация (HDR) – поздняя S – G2 фаза
Лигирование негомологичных концов (NHEJ) - G1 фаза

Репарация
двунитевых
разрывов ДНК
Эксцизионная
репарация
Ошибки
репликации
γ-облучение
УФ-облучение
Распознавание
Процессинг
Лигирование
негомологичных
концов
ИЛИ
Гомологичная
рекомбинация
Распознавание
Эксцизия
Застройка бреши
(репликация)
MSH2/MSH3,
MSH2/ MSH6
XPG, XPA, RPA,
HPF-ERCC1 и др.
Mre11-NBS1
-Rad50, 53BP1,
Ku70/Ku80, PARP
XPC-hHR23
TFIIH
MLH1/PMS2,
MLH1/MLH3
нуклеазы

– MSH2,6, MLH1, PMS2
неспаренных оснований
Нарушения репарации ДНК
– XPG, XPE, XPA и др.
нуклеотидов (NER)
Cиндром Линча II - неполипозный
рак толстой кишки, рак яичника
Пигментная ксеродерма,
рак кожи
Эксцизионная
Наследственные заболевания, связанные с повреждением систем репарации ДНК

– NBS1, LIG4
Двунитевых разрывов
– FANCA, FANCG и др.
Межнитевых сшивок
Ниймегенский синдром,
лимфоидные новообразования
Анемия Фанкони,
острый миелолейкоз и др.
Контроль рекомбинаций ДНК
– BLM, WRN и др.
Хеликазы
Синдромы Блюма, Вернера и др.,
лейкозы и др. новообразования
– MSH2,6, MLH1, PMS2
неспаренных оснований (BER)
Нарушения репарации ДНК
– XPG, XPE, XPA и др.
нуклеотидов (NER)
Cиндром Линча II - неполипозный
рак толстой кишки, рак яичника
Пигментная ксеродерма,
рак кожи
Эксцизионная
Наследственные заболевания, связанные с повреждением систем репарации ДНК

Характерные для опухолевых клеток
изменения генома
Генетическая нестабильность
Понижение
точности реп-
ликации ДНК
и сегрегации
хромосом
Нарушения
систем
репарации
ДНК
Повышение
продукции
РФК и др.
эндогенных
мутагенов
Ослабление
чекпойнтов
клеточного
цикла
Понижение
детоксикации
эндогенных
и экзогенных
мутагенов

Повреждение ДНК
Белки-сенсоры
аномальных структур ДНК
Восстановление
структуры ДНК
Белки
репарационных
систем
Остановка
деления, апоптоз
Передатчики сигналов
(BRCA1,ATM/ATR и др.)
Chk1, Chk2,
р53 и др.
связывание белков,
фосфорилирование

Гомологичная
рекомбинация
Остановка
в G2/M (?)
Остановка в G1, G2
Остановка в G1, S
Двуцепочечный
разрыв ДНК
BRCA1 и BRCA2 служат платформами для сборки разных белковых комплексов, обеспечивающих репарацию ДНК или арест клеточного цикла

Изменения в делящихся фибробластах мышей
c дефектным BRCA2 (brca2-mut/brca2-mut)
Метафаза с разрывами и
рекомбинациями хромосом
Дефектный цитокинез
(абсцизия)

G1
S
G2
Митоз
Нарушения
структуры
ДНК
p53
Механизмы подавления активности циклин-зависимых киназ и остановки клеточного цикла при повреждениях ДНК
p21Cip1
CycE
Cdk2
CycA
Cdk2
CycB
Cdc2
Cdc25A,C
pRb
ATM, ATR
Chk1, Chk2
BRCA1
TopBP1

ATM
Aтаксия-телеангиоэктазия,
лимфолейкозы, лимфомы
BRCA1, BRCA2
Рак молочной железы, яичника
p53, CHK2
Синдром Ли-Фраумени –
различные новообразования
Сигнализация от
поврежденной ДНК
– MSH2,6, MLH1, PMS2
неспаренных оснований
Нарушения репарации ДНК
– XPG, XPE, XPA и др.
нуклеотидов (NER)
– NBS1, LIG4
Двунитевых разрывов
– FANCA, FANCG и др.
Межнитевых сшивок
Ниймегенский синдром,
лимфоидные новообразования
Cиндром Линча II - неполипозный
рак толстой кишки, рак яичника
Пигментная ксеродерма,
рак кожи
Анемия Фанкони,
острый миелолейкоз и др.
Эксцизионная

Характерные для опухолевых клеток
изменения генома
Генетическая нестабильность
Понижение
точности реп-
ликации ДНК
и сегрегации
хромосом
Нарушения
систем
репарации
ДНК
Повышение
продукции
РФК и др.
эндогенных
мутагенов
Понижение
детоксикации
эндогенных
и экзогенных
мутагенов
Ослабление
G1, S, G2 и
митотических
чекпойнтов

Chin and Yeong, Mol. Cell.Biol., 2010: 22–32
Антефазный чекпойнт (Antephase checkpoint)
Aurora kinase A,
Polo-like kinase 1

Метафазный чекпойнт (Spindle checkpoint)
Kim and Yu, Semin Cell Dev Biol. 2011, 22(6):551-558.
APC/C - Anaphase promoting complex or cyclosome
Все кинетохоры должны быть прикреплены к веретену деления

Метафазный чекпойнт (Spindle checkpoint)

G1
S
G2
Митоз
Нарушения
структуры ДНК
Нарушения веретена деления
Bub1, Bub3
BubR1, Mad1/2
p53
p21Cip1
CycE
Cdk2
CycA
Cdk2
CycB
Cdc2
Cdc25A,C
ATM, ATR
Chk1, Chk2
Метафаза
Анафаза
Профаза
APC/C
(Е3 убиквитинлигаза)
Chfr
(Е3 убиквитинлигаза)
Неприкрепленный
кинетохор
Разрушение
микротрубочек
Aurora kinase A,
Polo-like kinase 1
Cепараза
Cекурин
Механизмы остановки клеточного цикла
при повреждениях ДНК

20-40% различных опухолей
(рак желудка, носоглотки и др.)
Гиперэкспрессия AURKA
Многие новообразования
Мутации MAD2
Bub1, Bub3, BubR1
30-40% раков желудка,
5-10% раков толстой кишки
Инактивация Chfr
Изменения митотических чекпойнтов
в опухолевых клетках человека
Гиперэкспрессия PLK1
Рак желудка,
В-клеточные лимфомы

Характерные для опухолевых клеток
изменения генома
Понижение
точности реп-
ликации ДНК
и сегрегации
хромосом
Генетическая нестабильность
Нарушения
систем
репарации
ДНК
Повышение
продукции
РФК и др.
эндогенных
мутагенов
Ослабление
чекпойнтов
клеточного
цикла
Ослабление
индукции
апоптоза и
аутофагии

Повышенная изменчивость
неопластических клеток
Увеличение вероятности
появления клонов клеток
с изменениями структуры
и/или копийности генов
Увеличение вероятности
эпигенетических изменений
(метилирования ДНК и др.)

Метилирование ДНК – важный механизм тканеспецифичной регуляции генной транскрипции
Осуществляется метилтрансферазами (Dnmt1, Dnmt3, Dnmt3a)
по 5-му положению цитозинового остатка динуклеотидов 5’CpG.
Метилированные сайты узнаются определенными белками (MeCP2
и др.), привлекающими многокомпонентные комплексы, содержащие
HDAC, что индуцирует деацетилирование гистонов, компактизацию
хроматина и, как следствие, подавление транскрипции генов.

Метилирование опухолевых супрессоров в новообразованиях
Метилирование промотора гена p16INK4a

Метилирование
CpG-островков в
промоторах генов
Для опухолевых клеток характерно:
Деметилирование промоторов регуляторных генов и одиночных
CpG-динуклеотидов
Подавление транскрипции
генов опухолевых супрессоров
(RB, INK4, E-кадгерин и др.) и
компонентов систем репарации
ДНК (MLH1 и др.)
Активация Ras, инактивация р53
ДНК-метилтрансфераза-1
Инактивация APC и др.
Деметилазы
Отмена
рост-ингибирующих
сигналов
Мутагенез,
рекомбинации
ДНК
Блокирование
дифференцировки

активация онкогенов RAS
инактивация опухолевого супрессора р53
Понижение
точности
репликации
ДНК
Повышение уровня
эндогенных мутагенов
(активные формы
кислорода )
Ослабление
G1- и G2-чекпойнтов
клеточного цикла при
повреждениях ДНК
Ингибирование
апоптоза при
повреждениях
ДНК
Эпигенетическая
репрессия генов
(метилирование
промоторов)
Ослабление
MAD3-зависимого
митотического
чекпойнта
Амплификация
центросом,
многополюсные
митозы
Нарушения
систем
репарации
ДНК