Физико-химические свойства белков. Количественные (колориметрические) методы определения концентрации белка презентация

Химические свойства аминокислот. Реакции α-карбоксильной и α-аминогрупп; реакции боковых радикалов. Цветные реакции на аминокислоты и белки.
Неионизованная и цвитеринная форма

Изоэлектрическая точка
Величина изоэлектрической точки амфотерной молекулы определяется величинами констант диссоциации кислотной и основной фракций:
Метод применяют для изучения белков, которые отличаются значениями изоэлектрической точки, то есть соотношением остатков кислых и основных аминокислот.
Изоэлектрическое фокусирование — технология разделения молекул по разнице в их изоэлектрических точках. Это разновидность зонального электрофореза, которую обычно проводят в геле.

Изоэлектрофокусирование

Титрование аминокислот
Нейтральные аминокислоты
метод количественного/массового анализа, используемый в аналитической химии, основанный на измерении объёма раствора реактива точно известной концентрации, расходуемого для реакции с определяемым веществом

Титрование аминокислот
Отрицательно заряженные аминокислоты
4,25+2,19
2
pI=

Химические свойства аминокислот
Реакции α-карбоксильной группы

Химические свойства аминокислот
Реакции α-аминогруппы

Химические свойства аминокислот
Реакции боковых радикалов
Реакция Сакагучи
Цветная реакция на аргинин дающий ярко-красное окрашивание в щелочной среде при взаимодействии с a-нафтолом.

Химические свойства аминокислот
Реакции боковых радикалов
Реакция Фоля
(Качественная реакция на цистин и аминокислоту цистеин)

Определение аминокислотной последовательности белков
Методы основанные на последовательном отщеплении концевых аминокислот
С N-конца
Реагенты:
Дансил хлорид или 1-фтор-2,4-динитробензол (реактив Сенджера)
Фенилизотиоцианат (Реактив Эдмана)
Аминопептидаза
С С-конца
Карбоксипептидаза

Современные подходы к определению аминокислотной последовательности белков (протеомные технологии)
Масс-спектрометрия

Масс-спектрометрия

Денатурация белков
Нарушение трёхмерной структуры белка, способное повлечь за собой потерю его функции

Денатурация белков
(NH3)2SO4
HNO3 (конц.)
ацетон
Обратимая
Необратимая
Температурные воздействия
Минеральные кислоты
Органические растворители
Нейтральные соли
Нагревание

Оптические свойства аминокислот
В области видимого спектра растворы аминокислот практически не поглощают, а в УФ-области поглощают растворы только тех аминокислот, которые содержат в молекуле бензоидные фрагменты или гетероциклические ядра ароматического характера - фенилаланин, тирозин, гистидин, триптофан.
Относительно интенсивное поглощение при X = 260-290 нм характерно для тирозина и триптофана. Поглощение тирозина при 280 нм используется для определения содержания белка в растворах.

Закон Бугера-Ламберта-Бера
I0 – интенсивность падающего на образец света
I – интенсивность света после прохода через образец
ε – величина поглощения 1М раствора изучаемого
вещества в кювете с длиной оптического пути 1 см

Методы количественного определения белков. Спектрофотометрические и колориметрические методы определения концентрации белков.
Колориметрия — физический метод химического анализа, основанный на определении концентрации вещества по интенсивности окраски растворов
Спектрофотометрия — физико-химический метод исследования растворов и твёрдых веществ, основанный на изучении спектров поглощения в ультрафиолетовой (200—400 нм), видимой (400—760 нм) и инфракрасной (>760 нм) областях спектра

Калибровочная кривая

Определение концентрации белка с помощью красителя бромфенолового синего
Бромфеноловый синий
Чувствительность метода:
10 мкг/мл
Метод основан на связывании красителя бромфенолового синего с белками в кислой среде. При этом образуется окрашенный комплекс синего цвета с максимум поглощения при длине волны 610 нм.

Биуретовый метод определения концентрации белка
Образование в щелочной среде окрашенного в фиолетовый цвет комплекса пептидных связей белков с ионами двухвалентной меди
Чувствительность метода:
от 2 до 10 мг белка в пробе; микрометод - от 0,1 до 2 мг

Определение концентрации белка по методу Лоури с применением реактива Фолина-Чокальтеу
Чувствительность метода:
10-100 мкг белка
В щелочной среде ионы Cu+2 образуют комплекс с пептидными связями, переходя в Cu+. Одновалентные ионы меди реагируют с реактивом Фолина (фосфомолибденовая кислота с фенолом), образуя нестабильный продукт, переходящий в молибденовую синь, с максимумом адсорбции при 750 нм

Работа в лаборатории

Стеклянные градуированные пипетки

Механический дозатор: правила работы
Сменный наконечник
Держатель под палец
Вращающаяся ручка поршня для изменения объёма
Механизм сбрасывания наконечника
Указатель установленного объёма
Посадочный конус для наконечника